2019, Vol. 31 
近几十年来，随着我国经济发展和城市化速度的加快，氮、磷等营养元素的排放导致水体富营养化进程不断加剧，其中氨氮浓度过高是造成水体富营养化的主要原因之一[1].废水异养硝化脱氮是对传统硝化理论的丰富与突破，也是目前水处理领域中关注和研究的热点[2-3].异养硝化菌由于具有世代周期短、生长速率快、环境耐受能力强等特点[4-6]，其在某些环境之中的异养硝化作用贡献可与自养菌相当, 甚至更大[7].目前，一些异养硝化菌也逐渐被筛选出来，例如假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)[8]、粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)[9]、木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)[10]等.
低温微生物是极端微生物之一，它们有着独特的生理功能以适应环境，研究这类微生物不仅具有重要的理论意义，而且在实际推广应用中产生了显著的经济效益和环境效益[11].但低温微生物在生活环境中要比中温微生物少，靠自然选择很难形成优势菌群，人工筛选、培育低温优势菌是扩大菌群的最佳途径.国内外对低温脱氮微生物已有一些研究，但都存在一定缺陷：1)温度偏高，接近常温菌，如闫法军等[12]从刺参养殖池塘环境中驯化分离筛选到一株低温有机物和氨氮降解菌株DB11，其对1~20 g/L质量浓度的刺参饵料液中NH3-N 3 d的去除率达91.7 % ~99.9 %，但该菌培养温度为15℃.赵燕[13]从青藏高原冰川冻土中分离纯化得到A1、A4、A6 3株低温菌，其对氨氮的去除率在58 % ~70 %之间，但该菌培养温度为16℃. 2)分离筛选的普通耐低温菌(并非专门的低温硝化或反硝化脱氮菌)对普通低氮废水具有一定低温脱氮效率菌，但对含氮高的低温废水脱氮效率就难以保证，如Chevalier[14]2000年从南极和北极成功分离到4株耐冷丝状蓝细菌，该菌在低温环境条件下对氮和磷有较高的去除率.徐巧等[15]从寒冷地区水土样品中在2℃下分离到一株耐冷型低温微生物，在5℃下对氨氮的去除率达90 %.冬季寒冷的气候条件致使污水处理系统中微生物数量减少，微生物对营养物质的转运减慢，吸收减少，对蛋白质合成速率降低，生命代谢活动减缓等[16]，从而导致冬季低温条件下生物脱氮效率大大降低.因此，从低温自然环境中分离、筛选出对含氮化合物具有较高代谢活性的耐冷型脱氮菌是提高寒冷地区低温季节氮污染水体原位生物修复效果的根本途径和有效措施[17].
本研究从冬季南四湖底泥中经驯化、分离和纯化得到一株能在低温及好氧条件下进行高效硝化的菌株，利用生物信息学方法对其进行鉴定，并对菌株的脱氮性能进行了分析，为其将来应用于冬季低温污水的生物脱氮提供了理论依据和菌种资源.
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种来源2016年12月-2017年1月(冬季)，在山东省南四湖新薛河人工湿地中采用柱状法采集表层0~20 cm泥样，放入已事先灭菌的样品袋中，编号，于4℃便携式冰箱中保存.湿地表层土壤温度为4~6℃.
1.1.2 培养基富集培养基(pH = 7.0)：用于异养硝化菌的富集培养；异养硝化培养基(pH = 7.0)：用于异养硝化菌的分离纯化及脱氮特性研究；牛肉膏蛋白胨培养基(pH = 7.2)：用于菌株的形态观察、保存及活化. LB培养基：唯一碳源基础培养基，碳源物质(葡萄糖、柠檬酸钠、乙酸钠、蔗糖、可溶性淀粉).各培养基的具体配置方法参考《微生物学实验教程》[18].
1.1.3 模拟污水配方模拟污水以葡萄糖为碳源、氯化铵为氮源、磷酸二氢钠为磷源，并添加适量的微量元素，使C :N :P = 100 :5 :1[15]，COD、氨氮、总磷的初始浓度分别约为1000、50和10 mg/L，pH为7.0.
1.2 方法 1.2.1 耐冷异养硝化菌的分离筛选将所采集的泥样放入4℃低温培养箱中培养驯化5 d，取驯化后的泥样1 g接入事先已灭菌，内装玻璃珠和100 ml富集培养液的三角瓶中，于6~8℃下振荡培养(160转/min)3 d，使微生物快速生长，达到富集的作用.将上述菌液接于无菌水中进行稀释处理，分别得到10-6~10-1倍的稀释液.选取10-6~10-4倍的培养液各1 ml，采用平板涂布法分别接种于异养硝化固体培养基平板上(设置3个平行)，放入6~8℃培养箱中培养并记录各平板菌株的生长状况.从中筛选出长势较好的24株菌株用平板划线的方法反复分离纯化直至获得单菌落，将单菌落接种到试管斜面培养基上，编号为Z01~Z24，于4℃冰箱内保存.
1.2.2 菌种的初筛与复筛将分离出的24株单菌落分别接种于LB培养基中6~8℃振荡培养(160转/min)至OD600为1.0左右时，在4℃、1200转/min下离心，弃去上清液，收集菌体细胞，加生理盐水摇匀，再离心，如此反复3次，以消除菌体携带的营养组分.然后用生理盐水调整菌体浓度，使其OD600值在0.8~1.0左右，备用.
将上述制备好的菌悬液以10 %的接种量接于异氧硝化培养基中，6~8℃振荡培养(160转/min)3 d，离心，取等量上清液滴加1 ml纳氏试剂，根据其颜色显示情况，最终选5株颜色最浅的编号Z01、Z05、Z13、Z20、Z23菌株进行复筛.
将初筛所得菌种按上述方法制备菌悬液，10 %的接种量接于异氧硝化培养基中，6~8℃振荡培养(160转/min)，并每间隔12 h测量培养基中菌悬液的OD600和氨氮浓度，计算出各菌株生长情况及氨氮去除率，筛选出氨氮去除率最好的菌株Z01进行进一步的研究实验.
1.2.3 菌种的鉴定肉眼观察菌落特征后，将菌株Z01染色并通过显微镜观察，记录其形态特征，再结合它的生理生化特性进行初步鉴定[19-20].
扫描电镜观察：将纯化好的菌株Z01转接至LB固体培养基，在30℃无菌条件下培养24 h左右.挑取菌株Z01，以无菌水洗涤多次.菌体先用3 %的戊二醛固定，漂洗，再用1 %的锇酸固定，最后用乙醇脱水.临界点干燥，粘台，喷金，在扫描电子显微镜下观察.
16S rDNA序列分析：菌株Z01经培养后提取总DNA，以此为模板，采用引物8f 5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3′ 20 bp和1492r 5′ GGTTACCTTGTTACGACTT 3′ 19 bp，将PCR产物克隆后由上海生工生物工程有限公司进行纯化鉴定.
1.2.4 生长条件探究生长曲线测定：将菌株Z01活化培养24 h后按10 %的接种量接种到异氧硝化液体培养基中，设置3个平行，在6~8℃振荡(160转/min)培养，每2 h取样测定OD600值，以平均值绘制生长曲线.
硝化特性探究：将菌株Z01接种到装有100 ml LB液体的培养基中，6~8℃振荡(160转/min)培养至达到对数生长期(OD600为1.0左右)作为菌种.离心，用生理盐水冲洗2~3次，再用生理盐水稀释至菌悬液OD600为1.0，备用.
将制备好的菌种Z01按1 % ~15 %的接种量接种到100 ml异氧硝化液体培养基中，在6~8℃振荡(160转/min)培养60 h后取样测定培养液中细菌的浓度(用OD600值表示)及氨氮浓度(设置3个平行).
其他条件探究如下：pH分别设置为1、3、5、6、7、8、9和10；盐度分别设置为0、0.1 %、0.3 %、0.5 %、1 %、3 %和5 %；碳源分别为乙酸钠、葡萄糖、柠檬酸钠、淀粉、蔗糖；温度分别为4、6、10、15、20、25和35℃；菌的投加量为最佳投菌量(每个条件设置3个平行).
1.2.5 菌株Z01对模拟污水的净化按照探究出的最适生长条件，对菌株Z01再次进行模拟废水去除实验，测量计算出其对氨氮和总氮的去除效率，与实验初期的去除效率比较，得出更加全面的实验结论.
1.2.6 水质指标的测定氨氮的测定采用纳氏试剂分光光度法，具体操作步骤详见《水和废水监测分析方法》(第4版)[20].
2 结果与讨论 2.1 耐冷硝化菌株的筛选经富集分离出的24株单菌在异氧硝化培养基中6~8℃振荡培养(160转/min)3 d后，其上清液滴加纳氏试剂的颜色变化结果见表 1.
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表 1 滴加纳氏试剂后上清液显色情况 Tab. 1 Coloration of the solution after a drop of Ghana's reagent |
从表 1可见，Z01、Z05、Z13、Z20和Z23的上清液滴加纳氏试剂后形成的黄棕色最浅(表 1).因为氨与纳氏试剂发生反应后生成黄棕色胶体化合物，氨浓度愈高，生成化合物的颜色愈浓.因此选择Z01、Z05、Z13、Z20和Z23 5株菌进行进一步的复筛，5株菌在异氧硝化培养基中的生长情况及氨氮去除率随时间的变化关系如图 1.
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图 1 5株菌株的生长量(a)和氨氮去除率(b) Fig.1 The growth (a) and NH3-N removal rate (b) of five strains |
由图 1a可以看出，菌株Z01、Z05、Z13、Z23在24~50 h内生长旺盛，繁殖迅速，处于对数期阶段，60 h后菌株生长逐渐进入稳定期，OD600趋于稳定.菌株Z20溶液的OD600最小，生长量最低，其原因可能是菌株Z20菌体细胞相互聚集在一起形成絮状沉淀，导致菌溶液中菌含量少，也可能是菌株Z20在生长过程中产生了一定量的沉淀分泌物，所以菌溶液OD600测定值较小.由各菌株生长情况可以看出，该5株耐冷异氧硝化菌进入稳定期的时间虽然比常温的异养硝化菌长[21]，但比其他耐冷硝化菌生长更迅速[22].
由图 1b可以看出，在培养0~60 h之间，随着培养时间的延长，5株菌对氨氮的去除率都呈上升的趋势，并于培养60 h左右达到最大值；60 h后各菌株氨氮去除率的变化幅度很小，基本趋于稳定.因此选取60 h时5株菌株的氨氮去除率作进一步的具体分析.
对比5株菌在培养60 h时对异氧硝化培养基中氨氮的去除率：菌株Z01的氨氮去除率最高，其去除率高达83.51 %；菌株Z05、Z13、Z20、Z23的氨氮去除率基本一致，无显著差异，其去除率为65.34 % ~67.91 % (图 1b).因此，本实验最终选定菌株Z01做进一步的研究.
2.2 菌株鉴定 2.2.1 形态学和生理生化鉴定将筛选出的菌株Z01进行形态观察及生理生化试验，在6~8℃下培养，菌株Z01表现为表面光滑、湿润，边缘较整齐，圆形凸起，不透明的圆形白色菌落.革兰氏染色试验菌株Z01呈阴性，扫描电镜下观察为短杆状，表面光滑无分泌物，大小为(0.6~0.8) μm × (1.1~1.4) μm(图 2).根据伯杰氏系统细菌学手册[23]对菌株Z01进行生理生化试验，其结果见表 2.
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图 2 菌株Z01的扫描电镜图 Fig.2 SEM of strain Z01 |
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表 2 菌株Z01的生理生化特性 Tab. 2 Physiological characteristics of the bacterial strain Z01 |
将送交上海生工生物工程技术服务有限公司测菌株Z01的16S rDNA序列通过BLAST检索GenBank中的核酸序列进行同源性比对，Clustal W和PHYLIP软件分析并构建了进化树(图 3).
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图 3 菌株Z01的系统进化树 Fig.3 Phylogenetic tree of the bacterial strain Z01 |
菌株Z01的16S rDNA特异序列为1385bp (GenBank接受号为MH220796)，与多株Pseudomonas sp. 16S rDNA序列的相似性达99 %以上.结合菌株的形态学及生理生化试验结果，可确定菌株Z01为假单胞菌属Pseudomonas sp.，命名为Pseudomonas sp. Z01.
2.3 菌株Z01的生长曲线从菌株Z01的生长曲线可以看出，在最初的30 h内菌株生长相当缓慢，处于生长延滞期.之后，随着培养时间的延长，菌株的生长速度明显加快，并于60 h左右达到最大值，60 h后菌株逐渐进入稳定期(图 4).因此，根据菌株的生长曲线，结合前面所做的菌株对废水去除效果的实验结果，可以大致确定后期实验所需菌种的培养时间约为60 h，因为此时菌株的生长速率最大，其生物活性最高，对废水各个指标的去除率相对最好.
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图 4 菌株Z01的生长曲线 Fig.4 The growth curve of strain Z01 |
接种量的大小决定了菌株的繁殖速度及数量，从而直接影响污水中的氨氮去除效果.在一定的培养时间内，接种量过小，菌株繁殖速度慢、数量少，从而影响氨氮去除效果.从图 5a可以看出，在1 % ~10 %的投菌量下，培养60 h后，随着投加量的增加，菌株Z01的细胞生长量也增加，10 %时达到最大.当投菌量增加到15 %时，菌株Z01的细胞生长量反而有小幅度的下降，其原因可能是，在一定的培养时间内，接种量过大，菌株的初始数量基数大，造成溶解氧不足，引起生物竞争而致使一些细菌死亡.在1 % ~7 %的投菌量情况下，培养60 h后，随着投加量的增加，菌株Z01对氨氮的去除率也增加，并在7 %的投加量时达到最大，为87.29 %.而当投菌量继续增加到10 %时，菌株Z01的细胞生长虽达到稳定期，但氨氮去除率并未达到最大，说明氨氮的去除不仅由细胞生长引起，同时也与细胞代谢有关.因此在实际操作中选择适当的投菌量对污水脱氮处理具有重要意义.综合考虑，本实验菌株Z01的最佳投菌量为7 %.
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图 5 不同条件下菌株Z01对氨氮的去除特性 (当pH为9和10时，氨氮去除率是扣除了空白组氨氮的挥发率之后菌株Z01对氨氮的去除率) Fig.5 The removal characterization of ammonia nitrogen by strain Z01 |
不同微生物所需的碳源种类也有所区别，如Pseudomonas sp. XS76可以利用丁二酸钠和柠檬酸钠进行良好的硝化反应去除氨氮[21]；Alcaligenes faecalis No.4只能利用有机酸才能进行硝化反应，从而去除氨氮[23].从图 5b可以看出，菌株Z01对5种碳源的利用程度和生长情况差异非常显著，在以葡萄糖和柠檬酸钠为碳源时，菌株Z01的生长及氨氮去除性能较好，尤其是添加碳源葡萄糖后，菌株Z01对氨氮的去除率高达86.44 %.在以乙酸钠为碳源的培养基中，菌株Z01的生长量急剧减缓，对氨氮的去除率也大幅度降低.而在以淀粉和蔗糖为碳源的培养基中，菌株Z01几乎不生长，对氨氮的去除率也极低，仅为1.63 %，这与王弘宇等[25]和潘丹[21]等的研究结果相似，可能与葡萄糖和柠檬酸钠作为前体物直接参与TCA循环有关.本研究中葡萄糖是菌株Z01异养硝化过程中的最佳碳源，柠檬酸钠其次.
环境中的pH值也是影响微生物生命活动的重要因素之一. pH主要作用是能够引起细胞膜电荷的变化，进而影响微生物对营养物质的吸收.此外，pH值还影响微生物代谢过程中酶的活性，改变生长环境中营养物质的可给性及有害物质的毒性[26].由图 5c可知，当pH值为6~8时，菌株Z01具有良好的氨化效果，培养60 h后，氨氮去除效率达82.21 % ~85.34 %.在酸性(pH≤4)或碱性(pH≥9)条件下，菌株生长状况都不好，基本没有氨化效果，说明该菌并不能适应强酸和强碱性的环境.若环境中的氢离子或氢氧根离子浓度超过了微生物酶的适应范围，微生物对营养物质的吸收和酶的活力都会受到影响.因此菌株能够耐受的pH范围为5~8，最佳pH为6~8，该菌在中性和弱碱性条件下氨氮去除效果显著.
盐度可以直接影响微生物的新陈代谢，进而影响其硝化性能.由图 5d可知，当NaCl浓度为0~0.3 %时，随着盐浓度的增加，菌株Z01生长量增加，其对氨氮的去除率也有所提高.当盐浓度为0.3 %时，菌株Z01的生长最好，氨氮的去除率最高，达83.74 %.当NaCl浓度进一步提高到0.5 % ~5.0 %时，菌株Z01的生长明显减慢，氨氮的去除率也急剧下降，其可能原因是：无机盐是生物细胞生长的一种必需元素，适量的无机盐对细胞具有积极作用，如调节细胞渗透压、激活和调节生物酶的活性、合成细胞有机物的原料、调节细胞pH值[27].如果培养液中盐不足，微生物细胞生长就会受到抑制.但相反，如果盐浓度过高，超过了细胞生长的需求量，微生物的生长同样受到抑制，微生物细胞会脱水甚至死亡.
温度是影响微生物生长与存活的重要因素之一.由图 5e可知，菌株Z01在6~25℃范围内均生长良好，在15℃时OD600值达到最大值，为1.722，氨氮的去除效率高达91.66 %.随着温度的升高或降低，菌悬液的OD600值都会降低，氨氮的去除效率也随着下降.因此，菌株Z01的最适温度为15℃.菌株在不同温度下生长情况的差异在于：温度影响细胞内酶的活性，改变细胞内蛋白质、核酸等生物大分子的结构与功能以及细胞的结构如细胞膜的流动性及完整性，从而影响微生物的生长、繁殖和新陈代谢[28].过高的温度导致蛋白质或核酸的变性失活，而过低的温度可严重影响生物处理的传质速率及微生物的生长代谢，进而降低菌株的氨化性能.
2.5 菌株Z01在最适条件下的去除率菌株Z01在最适条件下对人工模拟废水中氨氮、总氮、COD的去除率见图 6.当菌株Z01投菌量为7 %时，在温度为15℃，pH为6~8，盐度为0.3 %，最佳碳源为葡萄糖的条件下，第60 h模拟废水中氨氮的去除率高达91.57 %，约为最初去除率的1.1倍.同时，菌株Z01对模拟废水中总氮和COD也有较好的去除，其去除率分别为81.07 %和63.67 %.由此可见，菌株Z01能很好地利用废水中营养物质进行硝化作用，甚至是一定的反硝化作用，具体的有机物代谢及反硝化机理有待进一步研究.
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图 6 菌株Z01在最适条件下对模拟废水中氨氮、总氮和COD的去除率 Fig.6 The removal rates of NH3-N, TN and COD in polluted water by strain Z01 at its best conditions |
通过对菌株Z01在最适条件下的脱氮活性进行鉴定，发现菌株10不仅脱氮效果明显，且脱氮时间大大缩短.刘芳芳等[29]报道的4株粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)79、84、L116和L117经48 h对氨氮的去除率分别达到44.4 %、47.9 %、61.3 %和56.4 %.李晓亮[30]筛选到的菌株R14-ZY-5和CC6-YY-74以4 %的接种量于10℃、120转/min振荡培养，在96 h内氨氮去除率达83.31 %和82.82 %.王宏宇等[24]分离到的异养硝化细菌Pseudomonas sp. ZW2和Alcaligenes faecali ZW5经60 h培养对氨氮去除率分别为43.90 %和48.52 %.因而可以认定本实验分离筛选的菌株Z01是一株高效低温异养硝化菌.辛玉峰等[31]发现的Acinetobacter sp. YF14对氨氮去除率可以达到92 %，但该菌株所需的硝化时间长达3 d. Paracoccus denitrificans FJAT-14899不仅氨氮去除率高，且其硝化时间仅需12 h.
3 结论1) 从冬季南四湖人工湿地底泥中分离出5株生长较好且具有一定硝化性能的耐冷菌，并从中筛选出一株氨化效率最高的菌株，其氨氮去除效率高达83.51 %.经鉴定该菌株为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)，命名为Pseudomonas sp. Z01.
2) 分别对影响菌株的生长条件如生长时间、初始投菌量、pH、盐度、碳源、温度进行了研究，得到该菌株的最适生长条件：培养时间为60 h，初始投菌为7 %，pH为6.0~8.0，盐度0.3 %，温度15℃，最佳碳源为葡萄糖.
3) 在最适生长条件下，该菌株对模拟污水中的氨氮、总氮和COD均有较好的去除效果.
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