摘要
腐殖酸(HA)通过与产甲烷过程竞争电子抑制甲烷产生，是一种湖泊温室气体减排的自然策略。目前关于湖泊不同生境类型中腐殖酸结构特征及其对产甲烷过程的影响还缺乏系统性的认识。本研究旨在系统分析太湖不同区域沉积物中腐殖酸的结构特征及其对产甲烷的影响。采样区域涵盖东太湖、梅梁湾、湖心区和大浦口，分别采集表层沉积物进行定量分析。通过傅里叶红外光谱、分光光度法、元素分析、电子转移能力测量和醌类基团的定量测量，表征了HA含量、结构特征及氧化还原特性(包括电子接受能力(EAC)和电子供给能力(EDC))。结果表明，太湖4个区域的HA含量及其氧化还原特性存在显著空间差异。草型湖区(如东太湖)沉积物HA含量最高，而藻型湖区沉积物HA的EAC最强。相关性分析显示，HA的EAC与沉积物碳氮比呈显著负相关，与HA的芳香缩合度呈显著正相关。为了进一步明确太湖HA对产甲烷过程的影响，本研究在产甲烷菌富集体系中探究不同EAC的HA对产甲烷过程的影响，并通过测定甲烷累积量和辅酶F420相对活性来检测产甲烷过程。结果表明，随着HA的EAC增加，HA对产甲烷过程的抑制作用越显著，辅酶F420相对活性越低。这一发现表明湖泊HA的EAC通过抑制产甲烷菌活性，进而抑制甲烷的产生。未来的研究应进一步关注不同基质对湖泊HA形成机制的影响，以及影响HA的EAC的关键因素，以全面理解湖泊HA在气候变化调控中的潜在作用。
Abstract
Humic acid inhibits methane production by competing with the methanogenic process for electrons and is a natural strategy for reducing greenhouse gas emissions from lakes. There is still a lack of systematic understanding of the structural characteristics of humic acid in different lake habitat types and its impact on the methanogenesis process. This study aimed to systematically analyze the structural characteristics of humic acid (HA) in sediments from different regions of Lake Taihu and its effects on methanogenesis. The sampling area covers East Taihu Lake, Meiliang Bay, the central lake area and Dapukou, and surface sediments were collected for quantitative analysis. The content, structural characteristics and redox properties of HA (including electron accepting capacity (EAC) and electron donating capacity (EDC)) were characterized by Fourier transform infrared spectroscopy, spectrophotometry, elemental analysis, electron transfer capacity measurement and quantitative measurement of quinone groups. The results showed significant spatial differences in HA content and its redox properties among the four regions of Lake Taihu. The HA content in sediments from grass-type lakes (such as East Lake Taihu) was the highest, while the EAC of HA in sediments from algae-type lakes was the strongest. Correlation analysis showed that the EAC of HA was significantly negatively correlated with the carbon/nitrogen ratio of sediments and significantly positively correlated with the aromatic condensation degree of HA. To further clarify the effect of Lake Taihu HA on the methanogenesis process, this study explored the effect of HA from different EAC on the methanogenesis process in a methanogen enrichment system and monitored the methanogenesis process by measuring the methane accumulation and the relative activity of coenzyme F420. The results showed that as the EAC of HA increased, the inhibitory effect of HA on the methanogenesis process became more significant and the relative activity of coenzyme F420 became lower. This finding suggests that EAC from lake HA inhibits methane production by suppressing the activity of methanogens. Future studies should further focus on the effects of different matrices on the formation mechanism of lake HA and the key factors affecting the EAC of HA to fully understand the potential role of lake HA in climate change regulation.
自工业革命以来，温室效应已导致全球平均气温上升约1.2℃[1]。甲烷（CH4）在调控全球气候中发挥着至关重要的作用，其100年全球变暖潜力约为二氧化碳（CO2）的28倍[2]。湖泊是甲烷排放的重要自然来源，尽管其面积仅占全球无冰陆地表面积的3.7%，但湖泊排放的CH4约占所有自然生态系统排放总量的20%[3-4]。由于CH4在大气中的寿命远短于CO2，减少CH4排放能够在短中期内显著减缓温室效应[5]。因此，深入了解湖泊CH4产生的过程、机制及其对环境变化的响应，对于发挥湖泊在减缓全球变暖中的“制动器”作用至关重要。
腐殖酸（humic acid，HA）是湖泊沉积物有机质（organic matter，OM）的主要成分。近期研究提出，可以利用腐殖酸作为一种缓解全球变暖的策略，旨在通过其对微生物过程的调控作用减少CH4的产生，从而减轻CH4对全球气候变化的不利影响[6]。HA是由植物、动物和微生物残体形成的复杂有机大分子化合物，含有丰富的羧基（—COOH）、酚羟基（酚—OH）、醇羟基（醇—OH）、甲氧基（—OCH3）、羰基（C 
O）和醌基等含氧官能团，这些含氧官能团通过提供或接受电子、影响氧化还原电位以及促进电子转移路径的形成，显著影响HA的电子转移能力和氧化还原能力[7]。HA的基质物质显著影响HA的物理化学特征，例如来源于黑土的HA烷基碳含量最高，来源于黄棕壤的HA羰基碳含量最高，来源于黄潮土的HA芳香缩合度最大[8-9]。然而，不同类型湖泊沉积物形成的HA，在含量和结构上存在差异，这些差异可能会显著影响HA抑制产CH4的效果，但目前尚缺乏系统的研究。已有研究发现，HA作为环境中的一种末端电子受体，能够竞争流向CH4的电子，从而抑制CH4的产生[10]。尽管这一机制已得到初步验证，HA对产CH4过程影响行为受其基质材料的影响仍需深入探讨。
O）和醌基等含氧官能团，这些含氧官能团通过提供或接受电子、影响氧化还原电位以及促进电子转移路径的形成，显著影响HA的电子转移能力和氧化还原能力[7]。HA的基质物质显著影响HA的物理化学特征，例如来源于黑土的HA烷基碳含量最高，来源于黄棕壤的HA羰基碳含量最高，来源于黄潮土的HA芳香缩合度最大[8-9]。然而，不同类型湖泊沉积物形成的HA，在含量和结构上存在差异，这些差异可能会显著影响HA抑制产CH4的效果，但目前尚缺乏系统的研究。已有研究发现，HA作为环境中的一种末端电子受体，能够竞争流向CH4的电子，从而抑制CH4的产生[10]。尽管这一机制已得到初步验证，HA对产CH4过程影响行为受其基质材料的影响仍需深入探讨。
藻型湖泊和草型湖泊这两种典型湖泊生态系统，能够为HA的合成提供不同的基质材料以及形成环境。藻型湖泊沉积物中的藻类残体为HA的合成提供了高氮含量的基质材料，而在草型湖泊，水生植物残体则为HA形成提供了高碳含量的基质材料[11]。氨基酸是HA形成的重要基质材料，太湖不同区域表层沉积物中氨基酸的组成存在显著差异，浮游植物为主的藻型湖泊区域氨基酸占总有机碳和总氮的比例均高于水生植物为主的草型湖泊区域[12-13]。本研究推测高氮含量的基质材料有利于微生物对HA的加工，形成更高芳香缩合度、更多醌类基团以及更强电子接受能力的HA。沉积物中不同来源有机碎屑的分解速度和分解程度存在显著差异，藻类碎屑可以在4天内损失物质干重的50%，水生植物则需要0.5~12个月[14]。以水生植物为主的区域可能会因水生植物残体降解周期长，导致沉积物中保存着更多有机质，可以为HA的形成提供充足的基质材料。由于高碳含量的基质材料不易被微生物利用，可能影响HA的缩合过程。草型湖泊沉积物中的HA由于醌类基团和芳香性结构少，导致HA的EAC较弱，这可能不利于HA抑制产CH4作用的发挥。
太湖是中国第三大淡水湖，面积达2338 km2，平均深度为1.9 m[15]。太湖北部为藻类主导的藻型湖区，东部则为水生植物主导的草型湖区，这两个区域构成了两个不同的天然HA“孵化器”，为探究不同湖泊生境产生的HA对产CH4过程的影响提供了绝佳的天然实验场所[16]。此外，近三十年来，太湖富营养化问题日益严重，使其成为CH4排放的敏感区域[17]，因此，研究不同湖泊生境下产生的HA对CH4生成的影响变得尤为重要。本研究以太湖不同生态功能的湖区为研究对象，分别从草型湖区（东太湖）、藻型湖区（梅梁湾）、受自然扰动强烈的敞水区（湖心区），以及受人类活动影响显著的区域（大浦口）采集了表层沉积物，并提取其中的腐殖酸（HA）进行分析。通过定量提取、傅里叶红外光谱、分光光度法、元素分析、介导电化学测量以及醌类基团定量测量等方法，系统分析了不同湖泊生境下HA的含量和结构特征及其对沉积物产甲烷菌产CH4过程的影响，并阐明了不同EAC的HA对沉积物产甲烷菌产CH4过程的影响，为深入研究不同类型湖泊沉积物的产CH4过程提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 样品采集与理化性质分析
2022年7月，在太湖以大型植物为主的草型湖区东太湖（30°56′25.00″N，120°22′41.67″E）、以藻类为主的藻型湖区梅梁湾（31°27′12.69″N，120°8′50.52″E）、人类活动频繁的人类活动区大浦口（31°19′4.74″N，119°56′50.53″E），以及风浪剧烈的自然扰动区湖心区（31°14′48.65″N，120°12′3.67″E）各选择3个点位（图1），使用彼得森采泥器采集表层沉积物（5 cm以上），运回实验室后将新鲜沉积物-4℃冷藏保存，并将部分沉积物冷冻干燥保存。
图1太湖采样点位分布
Fig.1The distribution of sampling sites in Lake Taihu
将冻干沉积物样品研磨后过200目筛（75 μm），采用全自动元素分析仪（EA3000，Euro Vector，Italy）测定沉积物碳、氮元素。将研磨后的沉积物样品置于50 mL离心管中，加入1 mol/L HCl，在室温下静置12 h，以确保无机质充分溶解。待反应结束后，离心，用超纯水反复清洗沉淀，以确保去除残留的酸，得到的沉淀即为沉积物有机质。
沉积物中的易降解有机质和难降解有机质含量通过以下方式测定[18]。称取0.5 g样品置于50 mL离心管中，加入20 mL 2.5 mol/L 的H2SO4溶液，在105℃的烘箱中静置30 min，待样品冷却至室温后，离心，收集并保存上清液。随后，用20 mL超纯水清洗沉淀，离心后合并上清液。使用总有机碳分析仪（Torch，Teledyne Tekmar，USA）测定合并上清液的总有机碳（TOC）含量为易降解有机质1（labile organic matter-1，LOM-1，主要为非纤维素多糖类物质）。将剩余沉淀加入2 mL 13 mol/L H2SO4，于室温下静置过夜。之后将样品置于恒温摇床中振荡水解，水解完成后加入超纯水将酸浓度稀释至1 mol/L。在105℃烘箱水解3 h，期间每隔30 min摇动样品一次。水解结束后，离心并收集上清液。用20 mL超纯水清洗沉淀，离心后与上清液合并。测定合并上清液TOC含量为易降解有机质2（labile organic matter-2，LOM-2，主要为纤维素类物质）。最后，用超纯水将剩余沉淀清洗2次，置于60℃烘箱烘干，并测定残留物的TOC含量为难降解有机质（refractory organic matter，ROM）。
含水率通过差减法计算得出。精确称量湿沉积物的质量，记为湿重Wwet。将湿沉积物样品放入烘箱，在105℃的恒温下干燥，待恒重后，将样品取出放置于干燥器中冷却至室温，再次称量样品的质量，记为干重Wdry，含水率计算公式为：
(1)
1.2 沉积物腐殖酸提取
依照国际腐殖物质协会（IHSS）提供的方法提取HA，提取过程如下：首先，将沉积物去除杂质，冷冻干燥后研磨成粉末，过200目筛。然后，按1∶10的质量比将沉积物冻干样品与0.1 mol/L HCl溶液在室温下充分混合，用6 mol/L HCl将溶液的pH调至1，混合样品在恒温摇床中振荡1 h后静置12 h，待固液分层后去除上清液，收集沉淀物以进行进一步提取。将收集的沉淀物与0.1 mol/L NaOH溶液按1∶10的质量比混合，溶解后用1.0 mol/L NaOH将pH调至7.0，整个操作在N2环境下进行。随后，将混合液置于恒温摇床中振荡15 h，振荡结束后静置离心，收集上清液。将上清液用6.0 mol/L HCl酸化至pH=1.0，静置15 h后离心，收集粗制HA固体。为了进一步提纯，将粗制HA在N2条件下用0.1 mol/L KOH溶解，并加入KCl使溶液中的K+ 浓度维持在3 mol/L。接着，8000 r/min离心10 min以去除悬浮固体。然后加入6.0 mol/L HCl将pH再次调至1.0，静置15 h后离心，弃去上清液。最后，将沉淀置于塑料容器中，加入0.1 mol/L HCl与0.3 mol/L HF（体积比为1∶1）的混合溶液，在恒温摇床中振荡12 h后离心。去除上清液后，用超纯水多次洗涤沉淀物，直至对洗涤水加入硝酸银溶液后不再出现白色浑浊，即不再检测出Cl-。最后，将提纯后的HA样品冻干，得到纯化的HA。
1.3 沉积物腐殖酸特征分析
1.3.1 傅里叶红外光谱分析
采用 FT-IR光谱仪（Nicolet 6700，ThermoFisher Scientific，USA）对HA进行FT-IR光谱测定。将0.7 mg的HA与140 mg溴化钾研细混合后，放在真空烘箱中于110℃条件下烘干，把混合物压成薄片后，在1000~4000 cm-1 波数范围内记录图谱。
1.3.2 紫外分光光度计分析
称取 0.05 g HA，将其溶解在0.05 mol/L NaHCO3 中，并定容至100 mL，通过0.45 μm滤膜过滤去除颗粒物。在正式测量样品之前，用纯水或空白溶液对分光光度计进行基线校正，以消除溶剂的背景干扰。使用紫外分光光度计（UV-1200，MAPADA，China）将过滤后的样品溶液置于1 cm光程的石英比色皿中，分别在465和 665 nm 两个波长处测量其吸光度。E4/E6值为物质在465 nm 和 665 nm 两个波长处的吸光度之比。
1.3.3 电子转移能力测量
采用介导电化学氧化（mediated electrochemical oxidation，MEO）和介导电化学还原（mediated electrochemical reduction，MER）的方法对物质的EDC和EAC进行定量分析。介导电化学测试系统由电化学工作站（CHI600F，上海辰华，China）和介导反应装置两部分组成。实验在无氧操作手套箱中进行，电极电位恒定设置为0.61 V（介导氧化）或-0.49 V（介导还原）。首先，通过加料口向反应器中注入6 mL缓冲液，启动电化学测试程序并记录电流—时间曲线，稳定后添加100 μL 10 mmol/L ABTS（介导氧化）或ZiV（介导还原）作为介导剂。通过梯度加入10~50 μL的物质溶液或悬浮液，得到物质得失电子过程的时间—电流曲线。通过公式（2）和（3）对时间—电流曲线进行积分，定量计算物质的EDC和EAC:
(2)
(3)
式中，Iox为介导氧化电流; Ired为介导还原电流; F为法拉第常数，为96485 s·A/mol e-; m为每次注入反应体系物质的质量；t为反应时间，单位为s[19]。
通过上述方法分别测定沉积物及其有机质的EAC，HA的EAC和EDC。
1.3.4 醌类基团含量测量
将0.5 g/L的HA溶液分别装入两个血清瓶中，分别调节pH为6.5和8.0，并分别加入Pd-C和Pd催化剂。在H2环境中曝气30 min后，置于恒温摇床中反应24 h。取500 μL样品通过0.22 μm滤膜后，测定还原样品的电子转移数。去除样品中的剩余催化剂后，在空气中曝气30 min，再次取500 μL样品测定氧化样品的电子转移数。随后，将剩余样品在40℃下用N2曝气30 min，为一轮还原—氧化循环，该循环重复3次。将还原样品与氧化样品的电子转移量之差定义为样品的电子传递能力（electron transfer capability，ETC）。在N2-H2（体积比为95∶5）的厌氧条件下进行ETC的测定。将100 μL HA样品与100 μL铁氰化钾溶液混合，反应30 min后，采用Ferrozine法测定Fe（Ⅱ）浓度。根据Fe（Ⅱ）浓度计算HA向Fe（Ⅲ）转移的电子数量，并将在不同实验条件下得到的HA的ETC分别命名为ETCpH=6.5/Pd-C和ETCpH=8/Pd。根据ETCpH=6.5/Pd-C和ETCpH=8/Pd计算出醌类基团（Q）和非醌类基团（NQ）的含量[20-21]。
(4)
(5)
(6)
(7)
式中，ETC_RpH=6.5/Pd-C和ETC_RpH=8/Pd为HA分别在pH 6.5、8的条件下经过H2还原后的ETC，ETC_OpH=6.5/Pd-C和ETC_OpH=8/Pd为HA分别在pH 6.5、8的条件下经过空气氧化后的ETC，单位为mol e-。
1.4 腐殖酸的电子接受能力对产CH4过程的影响
1.4.1 制备不同电子接受能力的腐殖酸
首先，配制浓度为2 g/L的HA溶液，分别分装至3个密封的血清瓶中，并将溶液的pH值调节至8。在每个血清瓶中加入Pd-C催化剂，随后通入N2曝气30 min，以排除瓶内空气，确保无氧环境。接着，对每瓶溶液分别进行0、3和10 min时间的H2通气处理，以逐步还原HA，得到具有不同EAC的HA1、HA2、HA3。
处理后，将溶液置于150 r/min、25℃的恒温摇床中反应24 h。此后的所有操作均在N2-H2（体积比为95∶5）混合气体的厌氧手套箱内进行，首先除去Pd-C催化剂，并确保实验过程中无氧暴露。处理后的HA样品在遮光条件下保存，以避免光氧化效应的干扰。最后，采用介导电化学还原的方法测试HA1、HA2、HA3的EAC，分别为（427.36±3.33）、（382.14±1.64）和（301.77±5.01）μmol e- /g（dw）。
1.4.2 富集太湖沉积物产甲烷菌
首先，将液体培养基倒入平底三角烧瓶中，并置于电热炉上加热。在加热前，通入高纯N2（99.99%）以去除烧瓶内的O2。通过刃天青指示剂的颜色变化来判断无氧状态，刃天青呈无色时表示培养基已完全达到无氧条件。随后，将无氧培养基转移至血清瓶中备用，转移过程需在厌氧环境下（厌氧工作站内）进行。配制好的培养基在121℃下高温灭菌20 min，灭菌后冷却备用。在超净工作台上，将经过灭菌处理并冷却的液体培养基按10%的质量分数加入6 g太湖沉积物，接种于60 mL的液体培养基中，并密封血清瓶。为了维持严格的厌氧条件，操作过程中持续通入高纯N2。培养基接种前，每5 mL培养基中加入0.1 mL青霉素溶液以及0.1 mL无氧Na2S（1%）和NaHCO3（5%）的混合溶液。接种完毕后，培养基在37℃下恒温培养15 d，使用连续四次富集法对产甲烷菌进行富集。在培养的指数生长期（通常为8~10 d，具体根据CH4产生情况决定），将第一次富集物的6%转移至新的无氧培养基中，重复富集过程4次。通过高精度碳同位素分析仪（G2201-I，Picarro，USA）测定培养基上层气相CH4浓度来监测产甲烷菌的富集情况。
1.4.3 腐殖酸的电子接受能力对CH4产量的影响
将50 mL血清瓶在121℃下灭菌30 min，以确保无菌环境。灭菌后，向每个血清瓶中加入15 mL产甲烷菌富集液及0.4 g乙酸钠作为底物。实验采用控制变量法，在空白组（CK）中，向每个血清瓶中添加 5 mL 超纯水；在处理组（HA1、HA2、HA3）中，分别加入 5 mL 浓度为2 g/L的HA1、HA2、HA3溶液，所有HA溶液的pH值均调节至7，以模拟原位环境，每组均设置3次重复实验。
实验开始前，将所有血清瓶密封，并通过通入N2曝气 30 min以排出氧气，确保体系在厌氧条件下进行。实验体系设置完成后，将血清瓶置于恒温摇床中，在 150 r/min、25℃的条件下培养，确保溶液的充分混合和稳定的反应环境。每两天使用5 mL注射器抽取2 mL棕色顶空瓶中顶空气体取样，采用高精度碳同位素分析仪（G2201-I，Picarro，USA）测定CH4浓度。每次取完气体后，需采用高纯N2对顶空瓶顶空气体进行置换，共10 d，取样5次。
1.4.4 产甲烷菌辅酶F420活性测定
取 10 mL样品置于冰上冷却，并在16000 g离心力、4℃条件下离心30 min。随后，使用0.9%的生理盐水在4℃下对沉淀样品进行洗涤，并将样品置于生理盐水中浸泡30 min后，小心移去上清液。接着，使用蒸馏水洗涤沉淀3次，并将样品用蒸馏水重新定容至 30 mL。在水浴条件下将样品加热至95℃，持续30 min以确保处理完全。待样品冷却后，在12000 g离心力条件下离心20 min，随后加入2倍体积的乙醇，沉淀反应持续120 min以确保沉淀完全。最后，将样品在 12000 g离心力条件下离心20 min，收集上清液，并在 420 nm 处测定上清液的吸光度，表征辅酶F420的活性。
1.5 统计方法
CH4效应值以添加组CH4产量与对照组CH4产量的差值作为分子，并将对照组CH4产量作为分母进行归一化计算得出。区域位点实验数据通过单因素方差分析（ANOVA）检验，分析在SPSS 27.0（IBM，USA）中进行，若P＜0.05，则认为结果在0.05水平上具有统计学显著性，其中，P＜0.01、P＜0.001分别表示结果具有极显著性和非常显著性；若P＞0.05，则认为结果未达到该显著性水平。采用Logistics方程模型对厌氧产CH4动力学进行模拟。此外，采用Spearman相关分析和回归图统计沉积物HA结构特征与环境因子之间的相关性，分析在Origin 2024（Origin Lab，USA）中进行。使用ArcGIS 10.8（ESRI，USA）绘制太湖采样点位图；其他图均使用Origin 2024绘制。
2 结果
2.1 太湖沉积物特征分析
从表1可以得知，东太湖和湖心区沉积物具有较高的TOC含量，分别为（11.13±1.92）、（10.78±2.02）g/kg，其次是梅梁湾沉积物，TOC含量为（9.28±0.88）g/kg。大浦口沉积物的TOC和TN含量均为全湖范围内的最低值，分别为（7.20±2.68）和（0.80±0.29）g/kg。湖心区、东太湖和梅梁湾3个区域TN含量没有显著差异，分别为（1.21±0.26）、（1.26±0.18）和（1.22±0.12）g/kg。梅梁湾沉积物C/N比为全湖最低，为7.63±0.09，湖心区、大浦口和东太湖3个区域C/N比无显著差异，分别为8.97±0.66、9.03±0.25和8.86±0.39。
表1太湖沉积物特征分析
Tab.1Analysis of sediment characteristics of Lake Taihu
不同小写字母上标表示不同采样区域间差异显著（P＜0.05）。
经过分级提取区分沉积物有机质类型结果见图2a。多糖类易降解有机质1（LOM-1）含量全湖无显著差异，湖心区、大浦口、东太湖和梅梁湾分别为6.86、5.84、6.42和8.36 g/kg。而纤维素类易降解有机质2（LOM-2）含量由高到低分别是东太湖（20.62 g/kg）＞湖心区（18.34 g/kg）＞梅梁湾（18.10 g/kg）＞大浦口（14.40 g/kg）。难降解有机质（ROM）含量由高到低分别是东太湖（8.32 g/kg）＞湖心区（6.78 g/kg）＞梅梁湾（6.68 g/kg）＞大浦口（4.98 g/kg）。
太湖沉积物EAC全湖最高值在东太湖区域，为（175.91±8.23）μmol e-/g（dw），而梅梁湾沉积物EAC显著低于东太湖，为（150.66±30.72）μmol e-/g（dw）。湖心区和大浦口沉积物EAC则介于东太湖和梅梁湾之间，分别为（147.86±8.00）和（135.56±17.33）μmol e-/g（dw）（表1）。太湖沉积物有机质EAC全湖最高值仍是东太湖区域，为（2.02±0.46）μmol e-/g（dw），湖心区沉积物有机质EAC为（1.60±0.21）μmol e-/g（dw），而大浦口和梅梁湾沉积物有机质EAC显著低于东太湖，分别为（1.07±0.49）和（1.25±0.13）μmol e-/g（dw）（图2b）。
图2太湖沉积物理化性质：（a）易降解有机质1（LOM-1）、易降解有机质2（LOM-2）和难降解有机质（ROM）含量，（b）有机质的电子接受能力（EACOM）（不同小写字母表示采样区域间差异显著（P＜0.05））
Fig.2Physicochemical properties of sediments in Lake Taihu: (a) labile organic matter-1 (LOM-1) , labile organic matter-2 (LOM-2) and refractory organic matter (ROM) content and (b) organic matter electron accepting capacity (EACOM) (Different lowercase letters indicate significant differences among sampling regions (P＜0.05) )
2.2 太湖沉积物腐殖酸氧化还原特征及其影响因素
太湖表层12个沉积物样点均能通过IHSS方法提取得到HA，结果表明太湖表层沉积物HA含量变化范围为0.56~1.01 g/kg，全湖平均值为0.78 g/kg（图3a）。东太湖HA含量显著高于太湖其他3个湖区，含量为1.01 g/kg，湖心区、梅梁湾和大浦口HA含量相近，分别为0.56、0.72和0.71 g/kg。
在结构上，通过傅里叶红外光谱图（图3b）可以看出，太湖4个区域的HA在3330 cm-1（酚羟基O—H）、2920 cm-1（脂肪族—CH2）、1365~1625 cm-1（芳香环骨架）和1600 cm-1（羰基C
O和芳香族C C）处均出现特征峰，表明4个区域的HA在官能团类型上具有较大的相似性。
O和芳香族C C）处均出现特征峰，表明4个区域的HA在官能团类型上具有较大的相似性。
从表2可以得知，太湖4个区域的HA碳含量相对稳定，均处于50.50%~51.67%之间，未表现出显著差异（P＞0.05）。具体来看，HA碳含量由高到低依次为东太湖（51.67%±0.93%）、湖心区（51.35%±0.88%）、大浦口（51.16%±1.42%）和梅梁湾（50.50%±0.95%）。相比之下，HA氮含量则存在空间差异，其中湖心区的氮含量为6.53%±0.40%，大浦口为6.81%±0.43%，东太湖为6.28%±0.19%，梅梁湾则最高，达到7.05%±0.42%。梅梁湾HA氮含量显著高于东太湖（P＜0.05），而其他3个区域的氮含量在统计上没有显著差异。4个区域HA的C/N比也存在一定差异。湖心区、大浦口、东太湖和梅梁湾的C/N比分别为7.86±0.30、7.53±0.66、8.24±0.14和7.18±0.41。东太湖的C/N比显著高于梅梁湾，而湖心区和大浦口的C/N比处于中间水平，未表现出显著差异。E4/E6值方面，梅梁湾HA的E4/E6值最低，为4.29±0.11，显著低于其他区域（P＜0.05）。湖心区、大浦口和东太湖的E4/E6值分别为4.77±0.10、4.67±0.17和4.59±0.23。
表2太湖腐殖酸特征分析*
Tab.2Characteristic analysis of HA in Lake Taihu
*不同小写字母表示采样区域间差异显著（P＜0.05）。
图3太湖不同区域HA的理化性质：（a）HA含量（mHA/mSED），（b）傅里叶红外光谱，（c）电子接受能力（EAC）和电子供给能力（EDC），（d）醌类基团（Q）和非醌类基团（NQ）含量、（e）HA对于沉积物有机质（OM）的含量贡献和电子接受能力（EAC）贡献（不同小写字母表示采样区域间差异显著（P＜0.05））
Fig.3Physical and chemical properties of humic acid in Lake Taihu: (a) HA content (mHA/mSED) , (b) Fourier transform infrared spectroscopy, (c) electron accepting capacity (EAC) and electron donating capacity (EDC) , (d) quinone group (Q) and non-quinone group (NQ) content, (e) the contribution of humic acid to the content and the electron accepting capacity of sediment organic matter （Different lowercase letters indicate significant differences among sampling regions (P＜0.05) ）
通过介导电化学还原法和介导电化学氧化法测得太湖HA的EAC和EDC如图3c所示。结果表明，太湖沉积物HA的EAC（426.05~713.70 μmol e-/g（dw））远高于其EDC（52.67~122.86 μmol e-/g（dw））。梅梁湾HA的EAC（（713.70±9.97）μmol e-/g（dw））显著高于湖心区（（544.02±38.30）μmol e-/g（dw））。湖心区又显著高于东太湖（（452.07±39.29）μmol e-/g（dw））和大浦口（（426.05±37.49）μmol e-/g（dw））。4个区域HA的EDC由高到低分别为大浦口（（122.86±23.28）μmol e- /g（dw））＞东太湖（（91.01±47.03）μmol e-/g（dw））＞梅梁湾（（65.50±18.82）μmol e-/g（dw））＞湖心区（（52.67±9.12）μmol e-/g（dw）），且大浦口HA的EDC显著高于湖心区和梅梁湾。
太湖4个区域的HA中醌类基团（Q）和非醌类基团（NQ）含量存在显著差异。梅梁湾HA的醌类基团占比为82.46%±2.00%，为太湖HA的最大值，显著高于湖心区（38.33%±12.58%）、大浦口（66.60%±4.19%）和东太湖（29.91%±9.15%）（图3d）。同时，大浦口HA的醌类基团相对含量显著高于湖心区和东太湖。
太湖沉积物中HA仅占有机质含量的6%~11%，其中大浦口为11%±4%，东太湖为9%±1%，梅梁湾为8%±1%，湖心区为6%±1%（图3e）。而HA贡献了沉积物有机质24%~44%的EAC，其中梅梁湾显著高于湖心区、大浦口和东太湖，梅梁湾HA的EAC占其有机质EAC的44%±6%，其他3个区域由大到小排列为大浦口（27%±10%）＞湖心区（24%±3%）＞东太湖（23%±3%）。
如图4a所示，Spearman相关分析显示了影响太湖沉积物HA结构特征的环境因子。结果显示，HA的C/N比与其碳含量（P＜0.05）和E4/E6值（P＜0.05）呈正相关，而与氮含量（P＜0.001）和醌类基团含量（P＜0.05）呈负相关。HA的醌类基团含量与HA的氮含量（P＜0.05）和EAC（P＜0.01）呈正相关，并与E4/E6值（P＜0.001）和沉积物C/N比（P＜0.01）呈显著负相关。HA的EAC还与E4/E6值（P＜0.01）和沉积物C/N比（P＜0.01）呈显著负相关。同时，HA的E4/E6值与沉积物C/N比（P＜0.05）呈正相关。此外，沉积物C/N比与其纤维素类易降解有机质（LOM-2）含量（P＜0.05）也呈正相关。沉积物的TOC含量与TN含量（P＜0.001）、难降解有机质（ROM）含量（P＜0.01）呈显著正相关，而沉积物中的多糖类易降解有机质（LOM-1）含量则与其LOM-2含量（P＜0.05）和难降解有机质（ROM）含量（P＜0.01）呈负相关。同时，回归图表明太湖HA的EAC与其E4/E6值和沉积物的C/N比具有较好的线性负相关关系（图4b和图4c）。
2.3 不同电子接受能力的腐殖酸对产CH4过程的影响
实验设置如图5a所示，包括空白组（加入5 mL超纯水）和3个处理组（分别加入5 mL浓度为2 g/L的HA1、HA2、HA3溶液）。每组均含有15 mL产甲烷菌富集物和0.4 g乙酸钠作为碳源，用于比较不同HA的EAC对甲烷生成的影响。
实验结果表明，同种HA在3种不同EAC水平下均对CH4的产生存在抑制作用。CH4累积浓度如图5b所示，HA1、HA2、HA3组的CH4累积浓度分别为72.50、86.45和108.86 μmol/（L·L菌液），与对照组（CK）（140.51 μmol/（L·L菌液）相比，CH4产量分别下降了48.31%、38.35%和22.35%（图5e）。本研究还探讨了HA对产甲烷酶活性的影响，通过检测辅酶F420相对含量变化，初步判断体系中产甲烷菌活性的变化。将对照组（CK组）相对活性设为100%，处理组的辅酶F420相对活性分别为83.63%（HA1）、84.43%（HA2）和94.11%（HA3）（图5c）。
图5d散点图矩阵分析了HA的EAC、CH4效应值和辅酶F420相对活性的相互关系。结果表明，HA的EAC与CH4效应值（P＜0.001）和辅酶F420相对活性（P＜0.001）均呈显著负相关关系。
3 讨论
3.1 湖泊生境对沉积物有机碳性质及腐殖酸含量的影响
太湖沉积物有机质主要来源于内源有机质，草型湖区沉积物中TOC含量较高，这与沉水植物较少引发沉积物再悬浮，有机质得以更好地保存有关[22]。富含高碳水生植物的草型湖区TOC含量显著高于藻型湖区[23-24]。多糖类易降解有机质（LOM-1）在全湖4个区域中并无显著差异，但纤维素类易降解有机质（LOM-2）和难降解有机质（ROM）的含量在草型湖区均显著高于其他3个区域，可以推断不同湖泊生境下沉积物有机质的组成和含量不同，草型湖区具有更多有机质且主要体现在LOM-2和ROM含量上。
HA是有机物在腐殖化过程中所形成的一类复杂而又稳定的大分子有机化合物，其组成和结构特征受到基质类型等多种因素的影响[7]。太湖沉积物HA含量存在空间差异，东太湖沉积物HA含量显著高于湖心区、大浦口和梅梁湾。东太湖水体中存在丰富的水生植物，木质纤维素结构是水生植物的主要组成部分，而木质纤维素结构主要由木质素、纤维素及半纤维素组成[25]。因此，草型湖区沉积物中LOM-2和ROM含量显著高于其他区域。多酚学说认为HA是由简单的有机化合物（多元酚）和含氮化合物（氨基酸、多肽等）作为基质合成的[26]。LOM-2和ROM为HA的形成提供酚类基质，草型湖区由于具有更多的HA基质材料，更加适合HA的形成。
3.2 湖泊生境对腐殖酸电子接受能力的影响
太湖沉积物中的HA结构特征既存在共性，也存在空间差异。太湖4个湖区的HA傅里叶红外光谱图具有较大的相似性，且这一结果与顾志忙等在土壤中提取并表征的HA傅里叶红外光谱图相似，表明4个区域的HA在官能团类型上不存在显著差异，4个区域的HA均含有丰富的羧基、酚羟基、羟基和醛基等含氧官能团[27]。HA的氧化还原特性主要受醌、酚等官能团的影响，其中醌类基团在电子传递过程中起着关键作用[28]。太湖HA的醌类基团贡献了29%~82% HA的EAC能力，藻型湖泊沉积物HA的醌类基团含量显著高于草型湖泊HA。
图4影响太湖沉积物HA结构特征的环境因子分析：（a）Spearman相关分析，（b）HA的EAC与 HA的E4/E6值线性回归，（c）HA的EAC与沉积物C/N比的线性回归
Fig.4Analysis of environmental factors affecting the structural characteristics of HA in Lake Taihu sediments: (a) Spearman correlation analysis, (b) Linear regression of humic acid EAC and humic acid E4/E6, (c) Linear regression between humic acid EAC and sediment carbon to nitrogen ratio
通过相关性分析发现，HA的E4/E6值与其EAC呈显著负相关，即HA的芳香缩合度与EAC呈显著正相关[29]。HA的EAC还与沉积物C/N比呈显著负相关。HA的EAC由其结构特征决定，而结构特征又受基质特性的显著影响[30]。不同湖泊生境提供的基质物质存在显著差异，藻类残体富含氨基酸和蛋白质，不仅使形成的HA氮含量更高，还可能通过刺激相关微生物活性促进HA缩合[31]。因此，藻类残体形成的HA具有更多的醌类基团和更高的芳香缩合度，本研究也发现藻型湖区的HA具有更高的EAC。相比之下，水生植物占优势的草型湖区，沉积物HA的芳香缩合度和醌类基团含量较低，HA的EAC相对较弱。醌类基团是HA参与氧化还原行为的重要官能团。醌类化合物上的取代基位置决定了电子云在分子中的分布，影响电子的迁移通道，进而影响其电子传递效率[32]。因此，不同湖泊生境由于沉积物中基质的组成及分解缩合程度的差异，导致沉积物HA的EAC、氧化还原能力存在差异。相比草型湖泊，沉积物C/N比更低的藻型湖泊更适合缩合程度更高、EAC更高HA的“孵化”。
图5（a）太湖富集产甲烷菌体系实验设置示意图，以及（b）添加不同EAC的HA后CH4累积浓度，（c）辅酶F420相对活性，（d）HA的EAC、CH4效应值和辅酶F420相对活性散点图矩阵，（e）CH4效应值
Fig.5(a) Schematic diagram of the experimental setup for the methane-producing bacteria enrichment system in Lake Taihu, (b) cumulative concentration of CH4 after adding HA with different EAC, (c) relative activity of Coenzyme F420, (d) scatter plot matrix of HA's EAC, CH4 effect value and relative activity of Coenzyme F420, (e) CH4 effect value
3.3 腐殖酸的电子接受能力通过抑制产甲烷菌活性抑制甲烷的产生
EAC是HA抑制甲烷产生的重要因子，HA通过其EAC与产甲烷菌竞争电子，有效减少流向产CH4途径的电子，从而显著抑制CH4的生成[33]。具体而言，产甲烷菌依赖铁氧化还原蛋白（Fd）将甲基乙酰辅酶A（CH3COSCoA）裂解产生的电子传递给细胞膜上的氢化酶（Ech），这一过程是CH4生成的重要环节[10]。HA可以与Fd竞争电子，阻碍电子传递到Ech，最终降低CH4的生成效率，这种抑制作用在HA的EAC较高时表现尤为显著[34]。
此外，本研究发现辅酶F420的相对活性变化趋势与CH4产量的变化趋势一致，这进一步验证了HA对CH4生成过程的调控作用。HA通过直接从乙酸盐中接受电子并阻止乙酸盐转化为CH4，从而导致正常的乙酸型产CH4途径受阻[35]。同时，HA可能作为代谢中间物质，促进其他互养细菌的代谢，进一步削弱产甲烷菌在电子竞争中的优势，导致其活性下降[36]。
因此，高EAC的HA能够通过多种机制调控产甲烷过程，包括与电子传递体竞争、干扰关键代谢途径及调节微生物间的代谢平衡。在厌氧环境下，高EAC的HA表现出显著抑制CH4生成的潜力，进一步强调了EAC作为HA抑制产甲烷活性的重要因子。
藻型湖区沉积物HA的EAC显著高于草型湖区、人类活动区以及自然扰动区。尽管藻型湖区因富营养化而加剧了温室气体的释放，但该区域累积的惰性有机碳——HA，对湖泊沉积物中产CH4途径具有显著的抑制作用。HA通过竞争电子转移，能够有效减少CH4的生成，进而降低温室气体的排放。这种现象可能代表了一种自然的负反馈机制，使得藻类湖区能够在一定程度上缓解富营养化湖区所导致的温室气体排放增加的潜力。因此，人为提高藻型湖区沉积物HA含量，或可成为调控湖泊甲烷生成过程的一种策略。
尽管本研究揭示了太湖HA对产CH4过程的抑制作用，但仍有一些关键问题需要进一步探讨。例如，HA的EAC在不同环境条件下的变化机制尚不明确，不同基质物质如何影响HA的形成过程也需深入研究。此外，HA对产CH4抑制作用的长期效应仍需通过进一步的野外实验和模拟研究来验证。未来的研究应继续关注不同类型湖泊中HA的形成机制及其氧化还原特性在气候变化中的调控作用。
4 结论
本研究对太湖表层沉积物中的HA进行定量和定性分析，并通过添加不同电子接受能力（EAC）的HA，探讨其对沉积物产甲烷过程的影响，主要结论如下：
1）湖区生境对HA的含量和氧化还原能力具有显著的塑造作用，且在含量和EAC之间存在不对称性。相关性分析显示，HA的EAC与其芳香缩合度呈正相关，与沉积物C/N比呈显著负相关。草型湖区的HA含量显著高于藻型湖区，而EAC则显著低于藻型湖区。
2）EAC是HA影响沉积物CH4产生的重要因素，其通过抑制产甲烷菌活性从而减少产甲烷量。藻型湖区HA有更强的抑制产甲烷潜力，因此提高藻型湖区的HA含量有助于调控湖泊产甲烷过程，表明藻型湖区存在CH4的负反馈调节潜力。
