摘要
甲基膦酸（Methylphosphonate，MPn）作为具有C—P键特征的典型有机膦酸盐，其生物合成与降解过程深刻影响着水生生态系统的磷循环和甲烷（CH4）产生机制。然而，目前关于水体MPn变化及藻类MPn蓄积能力却鲜见报道。本研究采用液相色谱—串联四级杆飞行时间质谱联用（LC-MS/MS）技术，对21个水体样本及15株水华藻种进行MPn定量分析，并结合野外连续监测、室内藻类培养及原水培养实验（添加MPn/Pi(无机磷)、产甲烷古菌抑制剂2-溴乙烷磺酸钠处理、过滤除藻、避光处理），揭示MPn动态变化与CH4生成的关联。结果显示，52.4%（11/21）的水体样本检出MPn（(1.50±0.24)~(6.99±0.59) μg/L），93.3%（14/15）的藻株胞内蓄积MPn（(1.87±0.57)~(22.24±5.81) μg/L），其中微囊藻FACHB-3602胞内MPn在7 d培养中呈现动态积累（峰值为（8.63±0.85）μg/L），表明藻类是水生态系统MPn的重要生物源。在水样和藻类中，MPn-P对溶解性有机磷的贡献率（分别为0.70%~37.85%、0.21%~0.90%）均显著高于MPn-C对溶解性有机碳的贡献率（分别为0.00%~0.05%、0.00%~0.01%），凸显MPn生态化学计量特征以磷循环为主导。原水培养实验显示，添加MPn使CH4产量较对照组提升157.43%，同时添加Pi则抑制CH4生成；过滤除藻使水体产CH4平均浓度降低23.96%，避光处理则促进CH4积累，推测藻菌互作影响水体MPn周转与有氧CH4生成，且该过程受无机磷调控。本研究可为进一步探索MPn在水体磷循环中的作用以及有氧产CH4机制提供重要的理论支撑。
Abstract
Methylphosphonate (MPn), a typical organophosphonate characterized by a C—P bond, profoundly influences phosphorus cycling and methane (CH4) production mechanisms in aquatic ecosystems through its biosynthesis and degradation processes. However, there is limited research on the dynamics of MPn in water bodies and the MPn accumulation capacity of algae. This study employed liquid chromatography-tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometry (LC-MS/MS) to quantify MPn in 21 water samples and 15 algal species. Combined with field monitoring, algal laboratory cultivation, and raw water incubation experiments (including MPn/Pi addition, BES treatment, algal filtration, and dark treatment), the relationship between MPn dynamics and CH4 generation was investigated. The results revealed that MPn was detected in 52.4% (11/21) of water samples ((1.50±0.24)-(6.99±0.59) μg/L), and 93.3% (14/15) of algal strains accumulated intracellular MPn ((1.87±0.57)-(22.24±5.81) μg/L). Notably, Microcystis sp. FACHB-3602 exhibited dynamic MPn accumulation during 7 days of cultivation (peak value: （8.63±0.85） μg/L), indicating that algae are a significant biological source of MPn in aquatic ecosystems. In both water samples and algae, the contribution of MPn-P to dissolved organic phosphorus(0.70%-37.85%, 0.21%-0.90%) was significantly higher than that of MPn-C to dissolved organic carbon (0.00%-0.05%, 0.00%-0.01%), highlighting the dominant role of MPn in phosphorus cycling from an ecological stoichiometric perspective. Raw water incubation experiments demonstrated that MPn addition increased CH4 production by 157.43% compared to the control, while the simultaneous addition of inorganic phosphorus (Pi) suppressed CH4 generation. Algal filtration reduced CH4 production by 23.96%, whereas dark treatment promoted CH4 accumulation. These findings suggest that algal-bacterial interactions regulate MPn turnover and aerobic CH4 production, modulated by inorganic phosphorus availability. This study provides critical theoretical insights for further exploration of MPn's role in aquatic phosphorus cycling and aerobic CH4 production mechanisms.
Keywords
甲基膦酸（Methylphosphonate，MPn）作为结构简单的有机膦酸盐（分子式CH5O3P），其独特的C—P键特性使其成为碳、磷循环的关键化合物[1-3]。传统观点认为MPn属于生物不可利用磷，但近年来研究发现，在无机磷（Pi）限制条件下，多种微生物可通过裂解MPn的C—P键获取磷源以维持生长，揭示了该化合物在生物磷循环中的重要作用[4]。同时，MPn降解过程中甲基基团（—CH3）的断裂会与氢离子结合生成甲烷（CH4），这一过程已被证实是表层有氧水体CH4产生的重要机制[5]。
在气候变化背景下，藻类作为水生生态系统中的初级生产者，与MPn生物合成的关联性日益受到关注[6-8]。Dyhrman等[9]发现两株束毛藻Trichodesmium erythraeum IMS101和Trichodesmium erythraeum ST6-5合成的膦酸酯占细胞总颗粒磷的8%~17%，揭示其可能是海洋贫营养区膦酸脂的主要生物来源；Acker等[10]通过基因分析证实，MPn生物合成基因在原绿球藻Prochlorococcus SB和海洋浮游细菌主要类群SAR11中广泛分布。尽管目前已从海洋、淡水系统蓝藻中成功鉴定出mpnS、ppd、pdh等编码MPn合成的关键基因[10-14]，但针对水体和生物源MPn浓度变化的研究却寥寥无几，这在一定程度上制约了对MPn生物地球化学循环的深入解析。
近年来，富营养化湖泊中观测到的有氧产CH4现象与藻类活动呈现出显著相关性[15]。Willis等[16]证实尖头藻Raphidiopsis raciborskii CS-506在Pi缺乏时可通过矿化难降解有机膦酸盐维持竞争优势，这一发现为解析水华暴发的磷代谢机制提供了新视角。随着基因组学技术的发展，MPn降解途径及其功能基因的研究取得重要进展[17-19]。研究显示，束毛藻Trichodesmium erythraeum IMS101、聚球藻Synechococcus JA-2-3Ba（2-13）和鱼腥藻Anabaena cylindrica PCC7122等蓝藻均携带完整的MPn降解phn基因簇，可在膦酸盐为唯一磷源的培养基中生长[7，20-21]。更有实验证据表明，海洋与淡水系统中的微生物可通过好氧代谢MPn释放CH4 [2，22-23]。因此，研究水体和藻类中MPn浓度变化对预测CH4排放趋势有重要意义。
基于上述背景，本研究采用液相色谱—串联四级杆飞行时间质谱联用（LC-MS/MS）技术，系统检测了水体及藻类样本中MPn浓度，结合野外监测与室内受控培养实验，旨在阐明水体有氧CH4产生的潜在生物源。研究成果将为解析MPn在水体碳磷循环中的作用机制，以及评估藻类对水体CH4排放的贡献提供重要理论依据。
1 材料与方法
1.1 水样采集及藻种培养
本研究实验选用的15株藻种（微囊藻Microcystis sp.8株、束丝藻Aphanizomenon sp.2株、长孢藻Dolichospermum sp.2株、斜生四链藻Tetradesmus obliquus 1株、小球藻Chlorella sp.1株、聚球藻Synechococcus sp.1株）购于中国科学院水生生物研究所淡水藻种库（FACHB-Collection）。对15株藻种进行MPn浓度检测后，选取MPn单位浓度最高的藻种进行7 d实验培养。
选取三峡库区澎溪河流域高阳平湖和赤水河—盐津河小流域的6个点位水体进行MPn浓度检测。并对高阳平湖点位MPn、溶解性有机磷（DOP）、溶解性有机碳（DOC）进行连续15 d的跟踪监测，每天上午9：00采集高阳平湖表层有氧水体，用灭菌离心管将水样分装成3份，当天送到-20℃冷冻库保存，返回实验室一周内完成MPn浓度检测。此外，进一步采集高阳平湖水华期间的水样，用于实验室原水培养实验。
1.2 实验设置
1.2.1 培养实验一
选取MPn单位浓度最高的藻种（微囊藻Microcystis sp. FACHB-3602）进行7 d实验培养，分别于第0 h、12 h、24 h、36 h、2天、3天、5天、7天取样检测MPn、DOP和DOC浓度。所有藻种均保持在光强2000 lx、光暗比12 h∶12 h，温度25℃条件下培养，且在培养过程中每天将藻液手动摇动3次。在25℃下培养至对数期后，离心收集对数期藻细胞，用于正式实验。
1.2.2 培养实验二
将采集的高阳平湖原水水样剧烈摇晃以除去多余的CH4，构建6组原水培养体系。对照组为未处理原水，其余5组分别进行黑暗处理（双层铝箔避光）、GF/F滤膜过滤（Whatman，47 mm）处理、产甲烷古菌抑制剂2-溴乙烷磺酸钠（BES，500 μmol/L）添加、MPn（10 μmol/L）添加及MPn+Pi（各10 μmol/L）复合处理。所有样本分装于灭菌血清瓶（满容密封）中，置于恒温培养箱中培养3 d，培养条件为光强2000 lx、光暗比12 h∶12 h，温度25℃。于第0、12、24、36、48、60、72 h分别取样检测CH4浓度。
1.3 指标测定与分析
1.3.1 MPn定量分析
1）仪器设备的参数优化：本研究用于MPn分析的仪器为Agilent 1290-6530 Q-TOF MS四极杆飞行时间液质联用系统（美国安捷伦科技公司），仪器配备可检测低含量的喷射流电喷雾离子源（ESI）飞行时间质谱仪。分析样本前根据目标化合物MPn的特性选择“负离子模式”的电离检测方式，仪器设备参数参考Baygildiev等[24]的MPn检测方法并进行优化。
2）负模式的色谱参数如下：色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 RRHD（2.1 mm×50 mm，1.8 μm，美国），等度洗脱，柱温40℃。流动相A为甲酸水溶液，流动相B为乙腈，体积比为95∶5。流速为0.275 mL/min，每次分析时间为2.5 min。
3）负模式的质谱参数如下：在手动进样模式下，通过改变毛细管电压、破碎电压和锥孔电压优化MPn检测条件，模式为电喷雾负离子模式。干燥气温度设定为350℃，流速为10 L/min。毛细管电压设为2800 V，破碎电压设为90 V，锥孔电压设为60 V。扫描模式TargetedMS/MS，扫描速率2 spetra/s，碰撞能20 eV，母离子为95 m/z，子离子为（78.957±0.005）m/z。随后进行仪器控制和数据可视化，质谱数据分析使用专用软件包Agilent Mass Hunter Workstation（美国安捷伦科技公司）进行。
4）水样和藻类样本预处理。①水体样本：采集的水样解冻后经0.22 μm聚醚砜微孔滤膜过滤后上机进行检测。②藻类胞内：取5 mL藻液培养物，经0.45 μm醋酸纤维微孔滤膜，将滤膜移入10 mL离心管中，再加入5 mL去离子水，反复摇晃，等滤膜上的藻细胞重新融入去离子水后将滤膜用酒精灭菌过的镊子夹出，将离心管拧紧，用PE聚乙烯保鲜膜将样本包裹，放入-80℃的超低温冰箱冷冻8 h；然后取出并置于室温下溶解，重复冻融操作3次，再经超声波细胞破碎仪在冰浴中进行超声破碎（功率为40 W；周期设置：工作3 s/间隙3 s；时长设置为10 min），最后经0.22 μm聚醚砜微孔滤膜过滤，滤液直接用于测量藻类胞内MPn。③藻类胞外：上述5 mL藻液培养物经0.22 μm聚醚砜微孔滤膜过滤后，滤液上机进行检测。
5）水样和藻类样本MPn分析测试：所有样本经0.22 μm聚醚砜微孔滤膜过滤后，待用超声波脱气后将20 μL样本等量注入色谱仪。若样本含有较多杂质或较为浑浊，需对样本进行离心（于4℃以12000 r/min离心5 min）后待测。
6）质控方法：开始分析样本前，首先进行仪器状态检查和质量校正，样本溶液的进样体积指定为20 μL。随后根据仪器设备参数优化后的条件，MPn有效分离得到离子流谱图，每个样品需要重复检测4~5次，以确保数据准确。
1.3.2 水体和藻类DOC和DOP浓度的检测
在测定前，需要使用0.45 μm滤膜对水样和藻类样本进行过滤。溶解性总磷（DTP）减去溶解性无机磷（DIP）的值即为DOP浓度。参照《水和废水监测分析方法（第四版）》[25]中的钼锑抗分光光度法测定DTP、DIP。使用Shimadzu ® TOC-V分析仪进行DOC测定。
1.3.3 CH4浓度测定
采用顶空平衡法[26]提取溶解在水样中的CH4：用300 mL聚丙烯注射器筒收集200 mL水样，确保收集水样后的注射器筒密封且无气泡，然后在该注射器筒内采集100 mL高纯度氮气（＞99.99%）以形成顶部空间环境，震荡2 min达到平衡。收集顶空平衡后的100 mL气体样品至事前抽真空的铝箔气袋中，通过配备火焰离子化检测器（FID）的气相色谱仪（Agilent 8860 GC，美国）系统分析CH4浓度。气相色谱条件如下：色谱柱为AgilentG3591-81004与AgilentG3591-81121，载气为高纯氮气，流速为21 mL/min，柱箱温度为60℃，FID温度保持在275℃，进样量为1 mL，运行时间为12 min。
1.4 数据统计和分析
所有实验重复3次。采用Excel和Origin 2021软件进行数据处理与统计分析，并使用单因素方差分析（ANOVA）和克鲁斯卡尔—瓦利斯单程方差分析（Kruskal-Wallis test）对实验数据进行差异显著性分析，显著性水平设为P＜0.05，数据结果以平均值±标准差表示。
2 结果与分析
2.1 水环境样本中MPn浓度
21 个水体样本检测结果显示，MPn的检出率为52.4%（11/21），检出的水体样本MPn浓度介于（1.50±0.24）~（6.99±0.59）μg/L之间。藻类样本分析表明，93.3%（14/15）的藻株胞内存在MPn蓄积，MPn浓度范围为（1.87±0.57）~（22.24±5.81）μg/L。此外，除微囊藻FACHB-3602藻株外，其余藻株胞外均未检测到MPn。而长孢藻FACHB-1250在胞内、外均未检出MPn（图1）。
图1水体样本与藻类样本MPn浓度
Fig.1MPn concentration in water samples and algal samples
2.2 高阳平湖连续监测中MPn、DOP和DOC浓度变化
连续15 d监测显示，表层水体MPn浓度整体呈现先下降后上升再继续下降的波动性趋势，平均浓度为（1.39±2.18）μg/L。其中，第13天MPn浓度出现峰值，为（6.99±0.59）μg/L，第14天仍维持较高浓度，为（6.35±1.05）μg/L。水体中DOP浓度在实验初期快速积累，在第2天达到峰值（（0.05±0.01）mg/L），随后呈波动性变化，与MPn浓度的变化趋势较为一致。相比之下，DOC浓度变化在整体上较为平稳，平均为（3.04±1.09）mg/L，前3天保持稳定，第4天出现短暂波动，下降至（1.34±0.17）mg/L后又上升，随后保持幅度较小的波动（图2a）。在监测时间内，水样中MPn-P对DOP的贡献率（MPn-P/DOP，0.70%~37.85%）显著高于MPn-C对DOC的贡献率（MPn-C/DOC，0.00%~0.05%）（P＜0.05）（图2b）。
图2高阳平湖15 d连续监测水样中MPn、DOP、DOC浓度变化（a），以及MPn中P和C对DOP和DOC的贡献（b）（***表示P＜0.001）
Fig.2Variations in the concentration of MPn, DOP and DOC (a) , the contributions of P and C in MPn to DOP and DOC (b) in water samples from Lake Gaoyang during a 15-day continuous monitoring
2.3 微囊藻培养实验中MPn、DOP和DOC浓度变化
微囊藻的7 d培养实验显示，胞内MPn浓度变化在初期呈蓄积状态，并在第2天达到峰值（8.63±0.85）μg/L，随后经过3 d的培养后呈平稳下降趋势。胞外DOP浓度在实验前期持续上升，并在第5天达到最大值（1.13±0.51）mg/L，随后在实验末期下降至（0.32±0.04）mg/L。而胞外DOC浓度在实验周期维持相对稳定状态，在第2天出现短暂波动，浓度上升至峰值（21.71±0.25）mg/L，第3天后DOC浓度趋于平缓（图3a）。微囊藻中MPn-P对DOP的贡献率（0.21%~0.90%）显著高于MPn-C对DOC的贡献率（0.00%~0.01%）（P＜0.05）（图3b）。
2.4 原水培养实验添加MPn和Pi对CH4浓度的影响
原水培养实验显示，MPn+Pi组的CH4浓度变化幅度大于对照组与MPn组。添加MPn显著促进CH4生成，MPn添加组在48 h CH4浓度达到峰值（6.64±0.71）ng/μL，随后开始逐渐下降；实验后期MPn组72 h的CH4浓度与对照组相比提升了157.43%。当同时添加MPn与Pi（MPn+Pi组）时，CH4生成则受到抑制，CH4浓度在36 h时降至（3.99±1.24）ng/μL；在实验结束时，CH4浓度较MPn添加组降低41.15%。培养后期，3个实验组产生的CH4浓度呈平缓下降趋势，且MPn+Pi组的CH4浓度趋近于对照组（图4）。
图3微囊藻FACHB-3602 7 d培养实验中MPn、DOP、DOC浓度的变化（a），以及MPn中P和C对DOP和DOC的贡献率（b）（***表示P＜0.001）
Fig.3Variations in the concentration of MPn, DOP, and DOC (a) , the contributions of P and C in MPn to DOP and DOC (b) in a7-day cultivation experiment of Microcystis sp. FACHB-3602
图4原水培养实验中添加MPn组、同时添加MPn+Pi组与原水对照组的CH4浓度变化
Fig.4Changes in CH4 concentration among the MPn-treated group, MPn+Pi-treated group, and control group in the raw water incubation experiment
2.5 原水培养实验不同处理组CH4浓度变化
原水产甲烷抑制实验表明，各处理组的大多数值集中在均值附近，数据整体上呈现出良好的正态分布特性，表明实验重复性良好且随机误差可控。添加产甲烷古菌抑制剂BES处理组的产CH4平均浓度为（2.60±0.70）ng/μL，与对照组（（2.87±1.18）ng/μL）相比，BES使CH4平均浓度降低9.60%。过滤去除藻类组，CH4平均浓度下降至（2.18±0.43）ng/μL，较对照组中CH4浓度降低23.96%，在所有处理组中最低。而避光处理组CH4的平均浓度在所有处理组中最高，达到（3.03±0.74）ng/μL，较对照组中CH4浓度升高5.58%（图5）。
3 讨论
本研究通过对高阳平湖与赤水河水样的连续监测，揭示了MPn在水体中的普遍存在特征。环境样品中MPn的来源具有双重性：一方面源于天然生物合成过程，另一方面与人工合成污染物相关[27]。采样点位附近存在农田、生活污水、化工厂等潜在污染源时，该点位水样的MPn浓度可能会有所升高[28-29]。在天然生物来源方面，蓝藻等水生生物已被证实具备MPn生物合成能力[9，19]。
高阳平湖15 d的连续监测数据显示，表层水体MPn浓度呈现显著波动特征。这种动态变化揭示了水体中MPn的快速周转特性，如藻类生物合成持续输入MPn，而微生物降解过程则不断消耗该化合物[23]。MPn合成降解过程不仅调控DOP、DOC的浓度变化，同时受二者浓度梯度的反向调控[30]。值得注意的是，第13~14天出现的浓度峰值可能与水华藻类衰亡过程相关，此时藻类胞内储存的MPn大量释放至水体，为其他微生物提供了充足的产CH4底物来源。
对15株水华藻种的检测发现，14株藻细胞胞内均含有MPn，证实藻类是MPn的重要生物源。已有研究对蓝藻基因组中检测到的mpnS与pepM等关键合成基因亦为此提供了分子生物学证据[10-11]。微囊藻FACHB-3602在7 d培养期间胞内MPn呈现波动积累模式，这可能与其磷储存策略相关。随着藻类的生长阶段和环境Pi浓度波动，藻类通过调节MPn合成/分解代谢维持胞内磷稳态[9]。除微囊藻FACHB-3602外，藻类胞外均未检测出MPn，可能源于两方面：（1）MPn释放至藻细胞外部属于一种微量精密调控，其释放量低于现有检测方法检出限；（2）MPn作为细胞壁多糖和膜磷脂的结构组分，主要参与细胞机械保护等生理功能[31]。
图5原水培养实验中BES组、过滤组、黑暗组和原水对照组的CH4浓度变化
Fig.5Changes in CH4 concentration among the BES-treated group, filtered group, dark group, and control group in the raw water incubation experiments
进一步分析显示，在水体15 d连续监测和微囊藻7 d培养实验中，MPn-P对DOP的贡献率均显著高于MPn-C对DOC的贡献率，这一差异源于水体营养元素的生物有效性。碳元素相对磷元素而言，其来源广泛且浓度较高，这使碳的生物利用率相对较低。而MPn被生物降解时，其C—P键断裂，甲基转化为CH4释放，导致MPn的部分碳浓度消耗[31]。作为关键限制性营养元素，磷的生物需求强度显著高于碳，含C—P键的化合物主要作为磷源而非碳源被利用。如对念珠藻Nostoc sp. FACHB-892利用MPn的过程进行转录组分析表明，磷胁迫显著激活了高亲和力磷转运系统基因簇（pstSCAB）以及碱性磷酸酶基因（phoA、phoD）的表达，从而使磷的获取与利用效率显著提高。相比之下，碳代谢相关基因未表现出类似的变化趋势。因此，在生物源MPn中，磷元素的生物利用率高于碳元素。这种差异可能反映了生态系统中的一种反馈机制，藻类为了适应磷的有限供应，可能进化出了更高效的有机磷利用策略[11]。
本研究原水培养实验中，添加MPn组的水样CH4浓度显著提升，表明水体中存在高效的C—P键裂解系统。值得注意的是，当同时添加MPn与Pi时，CH4浓度较单一MPn处理组下降41.15%，这与Khatun等[32]的湖泊水样培养实验结果一致，表明MPn分解代谢过程中，微生物对膦酸脂生物利用相关基因表达是由磷限制诱导的，如磷限制条件可诱导phnJ基因表达上调，而Pi的补充通过负反馈机制抑制该基因表达[22]。类似调控模式也存在于藻类磷代谢过程：Pi充足时，藻类优先吸收无机磷；当Pi匮乏时，藻类通过Pho调控系统启动MPn等替代磷源利用途径[11，17，19，33]。
原水产甲烷抑制实验进一步验证了藻源型MPn的环境效应。添加产甲烷古菌抑制剂BES后，水体CH4产量仅降低9.60%，表明该系统中CH4生成主要由好氧微生物代谢途径主导。这一结果支持了当前的研究观点——藻类水华衰退期观测到的CH4暴发现象与经典产甲烷古菌途径无显著关联[34]。此外，与对照组相比，过滤除藻组CH4平均产量下降23.96%，进一步证明藻类是水环境中MPn贡献者。黑暗处理组CH4产量较对照组升高，可能与藻细胞缺乏光照，导致光合活性降低，随后衰亡释放胞内MPn供其他微生物利用有关[35-36]。这些发现与Zhao等[17]提出的“微囊藻可依赖藻际细菌对MPn降解实现磷补给”的假说相契合，即在磷限制条件下，微囊藻通过招募可吸收利用MPn的藻际细菌形成共生体系，细菌降解MPn产生的Pi反哺藻类生长，形成物质循环的闭环系统。这种藻—菌互作机制不仅影响水体MPn浓度的变化，更是藻类适应低磷环境的重要生存策略[17，37]。
综上，本研究系统揭示了藻类在水体MPn生物地球化学循环中的重要地位，显著改变水体有机磷库组成。未来研究需重点关注藻菌互作对MPn周转的调控机制以及该过程对CH4排放的潜在影响。
4 结论
1）水体样本中MPn浓度为（1.50±0.24）~（6.99±0.59）μg/L，不同藻种胞内MPn浓度为（1.87±0.57）~（22.24±5.81）μg/L，藻类是水体MPn的重要生物来源。
2）在水样和藻类中，MPn-P对DOP的贡献率均显著高于MPn-C对DOC的贡献率，表明MPn中磷元素的生物利用率大于碳元素。
3）藻菌互作影响水体MPn周转与有氧CH4生成，且该过程受无机磷调控。
