基于eDNA宏条形码的金沙江中下游大型底栖无脊椎动物多样性*
doi: 10.18307/2025.0331
陈锦贤1 ， 吕佳林1 ， 黄贵英2 ， 宁冶霜1 ， 彭智奇1 ， 陈晓1 ， 戈昕宇1 ， 陈凯3 ， 王备新1
1. 南京农业大学植物保护学院，南京 210095
2. 浙江泰顺县环境监测站，温州 325000
3. 温州市环境科技有限公司，温州 325000
基金项目: 生态环境部生物多样性调查与评估项目（2019HJ2096001006） ； 国家自然科学基金项目（41771052）联合资助
Diversity of macroinvertebrate in the middle and lower reaches of the Jinsha River based on eDNA metabarcoding *
Chen Jinxian1 ， Lv Jialin1 ， Huang Guiying2 ， Ning Yeshuang1 ， Peng Zhiqi1 ， Chen Xiao1 ， Ge Xinyu1 ， Chen Kai3 ， Wang Beixin1
1. College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095 , P.R.China
2. Taishun County Environmental Monitoring Station, Wenzhou 325000 , P.R.China
3. Wenzhou Environmental Technology Co., Ltd., Wenzhou 325000 ，P.R.China
摘要
金沙江是长江上游的重要生态屏障区，水生生物资源丰富但受梯级水电站开发影响严重。eDNA宏条形码技术可以高效、标准化地获取生物多样性数据，是国内外学者广泛认可的可替代传统生物多样性监测方法的技术。为探究金沙江干流大型底栖无脊椎动物（底栖动物）多样性空间特征和影响因子，2021年2月采用eDNA宏条形码技术和传统方法调查了金沙江中、下游干流河段16个样点的底栖动物，并监测了水体理化因子，收集了水坝环境数据。eDNA宏条形码技术共检测到底栖动物4门6纲15目24科46个可操作分类单元，传统形态学调查法共检测到3门5纲9目19科29属，两种检测方法均发现双翅目多样性最高。eDNA序列及形态学多度数据的分析都表明金沙江中、下游的底栖动物群落组成差异显著，基于eDNA的优势类群及群落α多样性指数均有显著差异。典范对应分析显示，海拔、高锰酸盐指数及样点上游电站年平均发电量是影响底栖动物群落特征的关键环境因子。研究结果表明，金沙江中下游底栖动物多样性存在明显的空间差异，梯级水电开发是底栖动物群落的主要胁迫因子。本研究为金沙江水生生物多样性保护与监测方法的改进提供了参考依据。
Abstract
The Jinsha River serves as a vital ecological barrier in the upper reaches of the Yangtze River. This area has been abundant in aquatic biological resources but is being severely impacted by the cascade hydropower stations along its watercourse. eDNA metabarcoding can efficiently and standardly obtain biodiversity data, widely recognized by both domestic and international researchers as a technology capable of replacing traditional methods for biodiversity monitoring. To explore the spatial pattern of benthic macroinvertebrate diversity and the related influencing factors in the Jinsha River mainstream, eDNA metabarcoding and traditional methods were used to sample the macroinvertebrates at 16 sampling sites along the mainstream of the middle and lower reaches of the Jinsha River in February 2021. Water physicochemical variables were simultaneously measured, and environmental data of hydropower stations were collected. The eDNA metabarcoding technique detected a total of 46 operational taxonomic units (OTUs) across 4 phyla, 6 classes, 15 orders, and 24 families of benthos, while traditional morphological survey methods identified 29 genera within 3 phyla, 5 classes, 9 orders, and 19 families. Both methods found that Diptera had the highest diversity. The middle and lower reaches of the Jinsha River showed significant differences in macroinvertebrate community composition, as revealed by both eDNA sequences and morphological abundance data. In addition, eDNA methods further detected the remarkable differences in the dominant taxa and alpha diversity between middle and lower reaches. Canonical correspondence analysis identified altitude, permanganate index, and the average annual power generation of hydropower stations in the upper reach of sampling sites as the key environmental factors affecting macroinvertebrate communities. Our results highlighted the significant differences in macroinvertebrate diversity between the middle and lower reaches of the Jinsha River and cascade hydropower development is the major stressor on macroinvertebrates. Our findings provide a reference for the improvement of biodiversity conservation and monitoring methods for aquatic organisms in the Jinsha River.
受人类活动影响，淡水生态系统的生物多样性丧失速度明显高于海洋和陆地生态系统[1]。科学准确地揭示生物多样性丧失过程与机制，对淡水生物多样性保护有重要意义[2]。快速、高效和标准化获取生物多样性监测数据，对揭示生物多样性丧失过程与机制有重要作用。eDNA宏条形码（environmental DNA metabarcoding）技术具有非侵入性、高灵敏性、流程标准化等优点，被认为是未来替代生物多样性传统监测与调查方法的重要技术[3]。eDNA包括生物体经由体表、尿液、粪便、黏液等释放到环境中表皮细胞的胞内DNA，以及细胞死亡裂解后释放到环境中的胞外DNA[4]。eDNA宏条形码技术是指通过高通量测序手段批量检测eDNA条形码的方法来监测物种多样性。在水域生态系统，eDNA宏条形码技术已成功应用于濒危稀有物种、入侵物种监测[5-6]和评估群落生物多样性[7]等。研究表明，eDNA方法监测到的鱼类物种丰富度与传统方法相当或更高[8-9]，但监测大型底栖无脊椎动物（底栖动物）不同生物类群时两种方法有各自的优势和局限性。例如，在监测昆虫纲时eDNA比传统方法更高效，软体动物与传统方法相当，但对环节动物的监测弱于传统方法[10]。目前，国内应用eDNA方法监测水生生物多样性的研究以鱼类为主，针对淡水底栖动物多样性的研究相对较少[11]。
长江上游的金沙江孕育了丰富的水生生物资源，其中不乏珍稀鱼类、浮游动植物和底栖动物[12]。金沙江也是水能资源极其丰富和开发利用程度最高的流域之一，水电基地数量位于全国首位[13]。然而，水电站建设通常导致水生生物资源严重衰退，加速生物多样性的丧失，甚至严重破坏区域生态平衡[14]。底栖动物活动范围相对固定，对环境变化敏感，被广泛应用于水质生物监测与水生态质量评估[15]。本研究以底栖动物作为生物评价的指示生物，结合传统方法和eDNA宏条形码技术，揭示金沙江中下游干流底栖动物多样性特征，分析环境因素和梯级水电站运行对底栖动物多样性的影响，为金沙江干流水生生物多样性提供数据和监测方法支持。
1 材料与方法
1.1 研究区域与样点设置
金沙江全长约2290 km，以云南石鼓镇和四川攀枝花为界，分为上、中、下游3个河段。金沙江是长江上游中泥沙含量最多的河段，但不同季节泥沙含量差异显著，冬季河水含沙量显著低于其他季节[16]。金沙江中下游干流因大量水电基地的建立，河流连通性和生境完整性已明显受到影响。
本研究选择枯水期（2021年2月）开展野外调查，此时水体中泥沙含量最低，流速和水深都适合水样和底栖动物的采集，且获取水样eDNA过程中滤膜不易堵塞。样点设置参考现有国家水质考核断面，考虑支流入江河口、水电站上下游等因素，一共设置16个调查样点（S01~S16），其中中游河段8个（S01~S08），下游河段8个（S09~S16，图1）。
1.2 环境因子的测定
采用便携式水质仪（Mettler toledo，SG 9）现场测定水温（WT）、pH、电导率（EC）和溶解氧（DO）（Mettler toledo，S4），按照《水和废水监测分析方法》（第四版）[17]采集和测定水体高锰酸盐指数（CODMn）、总氮（TN）、硝态氮（NO-3-N）及总磷（TP）浓度。通过中国水电顾问集团有限公司公示的各水坝环境影响报告书收集装机容量数据信息，采用GPS仪（Garmin eTrex）记录样点的经纬度、海拔（AL）以及水坝经纬度，并将其录入谷歌地图，采用测距工具沿河流中泓线测量样点和上游水坝之间的距离[18]。
图1金沙江中下游采样点分布
Fig.1Sampling sites located at the middle and lower reaches of Jinsha River
1.3 eDNA和底栖动物样品采集
利用无菌采样瓶在每个样点采集水样，采集时至少距水面10 cm，每个样点采集3个平行样品，每个平行样品采集500 mL且间隔至少5 m以上，然后用过滤器（Nalgene300-4100）和玻璃微纤维滤膜（Whatman GF/F，CAT No.1825-047）过滤水样[19]。过滤后的滤膜放入离心管并暂存于液氮中，带回实验室后于-20℃环境下保存。所有仪器和材料在使用前均紫外灭菌处理。
参照《生物多样性观测技术导则·淡水底栖大型无脊椎动物》[20]采集底栖动物。可涉水样点使用D型网（直径30 cm，孔径0.5 mm）采集15~20个样方，按照多生境采样的原则合理分配不同生境中的D形网样方。在不可涉水（水深 ＞ 3 m）点，使用Peterson采泥器（1/16 m2）在每个样点定量采集3个平行样[21]。所有样本经500 μm孔径的分样筛清洗后装入采集瓶，加入95%乙醇浸没固定。于实验室内挑拣所有底栖动物个体，参照形态学资料[22-24]鉴定至最低的分类单元。按照鉴定的分类单元将隶属于某一类群的所有物种或OTU在所有点位出现的次数进行加和，记为检出属次，以进一步探究两种方法的一致性。
1.4 eDNA提取、扩增与测序
eDNA采用上海生工Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒提取[19]。首先将滤膜剪成约3 mm的碎片，置于无菌离心管中，并加入ACL缓冲液与蛋白酶K消解6 h，随后参照试剂盒说明步骤完成eDNA提取。将500 mL超纯水过滤后的样本设为阴性对照（SN）。
使用通用引物mlCOlintF/jgHCO2198扩增线粒体COI基因，正向引物为mlCOlintF: 5′-GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC-3′，反向引物为jgHCO2198: 5′-TANACYTCNGGRTGNCCRAARAAYCA-3′，目标片段长度约为313 bp[25-26]。在每对引物的5′末端分别添加8个核苷酸作为标签，以区分每个测序组中的样品。所有eDNA样品进行3次PCR重复。本研究采用50 μL反应体系，包括44 μL MIX（北京擎科，金牌MIX）、2 μL正向引物（10 μmol/L）、2 μL反向引物（10 μmol/L）和2 μL DNA模板。扩增程序为：94℃，5 min；16个循环：95℃，10 s，62℃，30 s（每个循环依次减少1℃），72℃，60 s；25个循环：95℃，10 s，46℃，30 s，72℃，30 s；65℃，5 min[19]。利用浓度为2%的琼脂糖凝胶对每个PCR扩增产物进行检测。确认目标条带单一且明亮后，将每个样品的3个PCR扩增产物混合并使用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒（上海生工）进行纯化。纯化后的样品按浓度等比例混合后送至北京诺禾致源科技股份有限公司，在Illumina Hiseq 2500平台250 bp PE模式下进行测序（总测序量为4 Mb）。
1.5 生物信息分析
首先，利用SEED软件拼接组装测序数据[27]。其次，控制筛选出质量分数（quality scores，Q）≥ 30的序列[28]，保留长度在308~318 bp的序列，按照标签将序列分流为各个样点数据。接着去除引物与标签不匹配的错误序列，删去嵌合体。然后利用USEARCH对所得优质序列按照大于97%的相似度进行可操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）聚类[29]。接着通过R软件绘制稀释曲线判断样本测序深度的合理性。此外，通过BLASTn对所有OTU代表序列进行分类学注释，以中国淡水大型底栖无脊椎动物条形码数据库[30]作为参考数据库，保留相似度≥85%的OTU[31]，然后去除易引发假阳性错误的低丰度序列（序列丰度小于样本总丰度的0.005%）。
1.6 统计分析
中下游河段水环境差异分析采用基于欧氏距离的Ward-linkage聚类分析[32]，并采用ANOVA方差分析法检验单个环境变量在中下游间的差异。采用相对多度数据制作弦图及热图比较eDNA样本和形态学鉴定结果的物种组成，用曼惠特尼U（Mann-Whitney U）非参数检验分析比较中下游间底栖动物群落的Shannon-Wiener多样性指数、Simpson多样性指数、Margalef丰富度指数与Pielou均匀度指数的差异[33]。以物种多度数据计算Bray-Curtis距离作为β多样性的度量，通过距离矩阵进行主坐标分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）比较中下游群落组成的差异性，并利用置换多元方差分析（PERMANOVA）检验基于不同方法的中下游间群落差异的显著性。利用消除趋势对应分析（detrended correspondence analysis，DCA）的轴长确定两种采集方法均采用典范对应分析（canonical correspondence analysis，CCA）来调查样点沿环境综合梯度的分布特征，使用前向选择（forward selection）确定影响群落分布的关键环境因子。CCA分析前，通过方差膨胀系数（variance inflation factor，VIF）进行共线性检测，删去VIF＞10的高共线性环境变量，避免由于变量间的共线性造成的结果不合理[34]。数据分析和作图在R软件（Version 4.1.0）及SPSS 22软件中完成。
2 结果与分析
2.1 环境因子
金沙江中、下游的水体理化因子存在显著差异（表1），中、下游采样点在聚类分析结果中被划分为不同的组（附图Ⅰ）。中游的水温和总磷浓度显著低于下游，但电导率显著高于下游（P＜0.05）。中、下游的高锰酸盐指数、pH和溶解氧浓度之间无显著差异。
表1金沙江中游与下游河段环境变量差异（均值±标准差）
Tab.1 Difference in environmental variables between the middle and lower reaches of Jinsha River (mean±SD)
*表示该环境变量在中下游河段间存在显著差异，P＜0.05。
2.2 底栖动物物种组成
2.2.1 传统形态学方法
基于形态学方法（环节动物鉴定至纲）共检测底栖动物3门5纲9目19科29属（附表Ⅰ），共计出现48属次，平均每个点位发现3个属。节肢动物门丰富度最高（23属，占比为79.3%），其次为软体动物门（5属，17.2%）、环节动物门（1属，3.5%）。节肢动物门中的昆虫纲共采集到17属，占总分类单元数的58.6%。目级分类水平中物种丰富度最高的为双翅目（48.3%），其次为十足目（13.8%），蜉蝣目与中腹足目均占10.3%。物种多度最高的为双翅目（74.5%），其次为贻贝目（11.4%）、十足目（7.0%）。
2.2.2 eDNA检测结果
所有样点共获得2229918条序列，经过质量控制及筛选目标片段长度后得到1609750条序列，去除错配的嵌合体及单倍体后剩余747785条序列。稀释曲线显示每个样本基本上都趋于平缓（附图Ⅱ），说明样本的测序数据量是合理的。注释分类学信息后，筛选其中相似度≥85%、覆盖度≥50%的OTU，最终共检测到46个底栖动物的OTU（共4744条序列），包括4门6纲15目和24科（附表Ⅱ），共计出现88属次，平均每个点位发现5.5个属。其中，节肢动物门21个OTU，占OTU总数的45.7%；其他依次为环节动物门（14，30.4%）、软体动物门（9，19.6%）和扁形动物门（2，4.4%）。目级水平上，物种丰富度最高的为颤蚓目，占总OTU数的28.3%，其次为双翅目（17.4%）、蜉蝣目（13.0%）。物种多度最高的为帘蛤目（38.8%），其次为双翅目（25.9%）和单肠目（11.3%）。
eDNA法在每一个样点都检测到了底栖动物，但传统方法在4个样点未采集到底栖动物样本（图2）。eDNA检测到的物种丰富度显著高于传统调查法，但两种方法监测结果均表明，金沙江中游底栖动物多度高于下游。两种方法在科、属水平上共同采集到的种类较少（科：10.5%；属：5.6%；图3），体现了两种方法在丰富度检测上的互补性。
图2底栖动物群落组成弦图（a: 形态学；b: eDNA）（外圈：中游、下游、目级分类单元； 中圈：采样点、序列丰度；内圈：采样点群落组成）
Fig.2Chord diagram of macroinvertebrate community composition (a: morphology; b: eDNA） （Outer circle: middle reach, lower reach, and order taxonomic category; Middle circle: sampling sites, sequence abundance; Inner circle: community composition of sampling sites)
2.3 中游和下游底栖动物群落特征
eDNA多度数据表明，下游底栖动物群落的Shannon-Wiener多样性指数、Simpson多样性指数、Pielou均匀度指数均高于中游（图4）。形态学多度及丰富度数据表明，中游底栖动物有较高的群落多度和较低的物种丰富度。多元方差分析检验结果表明（图5），中下游底栖动物群落组成差异显著（eDNA：P = 0.045；传统方法：P = 0.041），其中第1轴的贡献率为19.6%（eDNA）和18.3%（传统方法），第2轴的贡献率为12.3%（eDNA）和17.2%（传统方法）。
在群落组成方面，eDNA结果表明，前3位优势类群在中游依次为帘蛤目（51.7%）、双翅目（33.6%）和鞘翅目（10.7%）；下游依次为单肠目（42.2%）、颤蚓目（34.2%）和双翅目（4.7%）。形态学结果表明，中游依次为双翅目（94.9%）、寡毛纲（2.8%）和中腹足目（0.9%）；下游依次为贻贝目（41.4%）、十足目（26.1%）和双翅目（18.5%）。利用两种监测方法均表明，双翅目类群在金沙江中下游干流占优势地位。
图3底栖动物群落组成热图 （颜色梯度表示相对多度等级，eDNA数据范围为0~4，形态学数据范围为0~3）
Fig.3Heatmap of macroinvertebrate community composition (color gradients indicate relative abundance levels, with eDNA data ranging from 0 to 4 and morphological data ranging from 0 to 3)
2.4 金沙江物种群落与环境因子的关系
基于eDNA多度数据，关键环境因子共解释28.02%的样点环境差异（附表Ⅳ），前向选择结果显示，中下游底栖动物的群落结构主要受海拔与高锰酸盐指数的影响（图6a）。其中，中游底栖动物群落结构与海拔及高锰酸盐指数均呈正相关关系，下游底栖动物群落结构与海拔及高锰酸盐指数均呈负相关关系。
基于形态学鉴定结果，关键环境因子共解释40.35%的样点环境差异（附表Ⅳ），前向选择结果显示，中下游底栖动物的群落结构主要受海拔与样点上游电站年平均发电量的影响（图6b）。其中，中游底栖动物群落结构与海拔呈正相关关系，与样点上游电站年平均发电量呈负相关关系，下游底栖动物群落结构与海拔呈负相关关系，与样点上游电站年平均发电量呈正相关关系。
3 讨论
3.1 金沙江底栖动物群落结构
eDNA结果表明，金沙江中下游干流底栖动物中节肢动物为优势类群，其中以昆虫纲为主（双翅目及蜉蝣目为主要优势类群），其次是环节动物门与软体动物门，与历史研究结果一致[35]。传统调查法在种类组成上同样以节肢动物门为优势类群，其次为软体动物门及环节动物门。本研究与同区域河段[35]相比，软体动物种类数占比升高，分析原因可能与水电站的建设有关。首先，水电站建设改变了水体的流动性和温度[36-37]，更有利于软体动物的生存和繁殖。其次，水电站建设可能导致水体中悬浮颗粒物的沉积[38]，为软体动物提供栖息地。最后，水电站建设可能导致水质富营养化[39]，间接导致刮食者多度增加。
图4底栖动物群落多样性比较（a: eDNA _ Shannon; b: eDNA _ Simpson; c: eDNA _ Pielou; d:形态学 _ Shannon; e: 形态学 _ Simpson; f: 形态学 _ Pielou）
Fig.4Comparisons of species diversity indices of macroinvertebrate (a: eDNA _ Shannon; b: eDNA _ Simpson; c: eDNA _ Pielou; d: morphology _ Shannon; e: morphology _ Simpson; f: morphology _ Pielou)
两种方法均表明，中游物种多度更高，而下游物种丰富度更高，这可能与中、下游样点的分布与结构有关。中游干流具有8座梯级水电站，目前有70%已蓄水，非自然河段占比为63.4%；下游包含4座巨型梯级水电站，且均已蓄水，非自然河段占比为96.9%[40]。本研究中游的底栖动物多度显著高于下游，与罗欢等[41]关于自然河段的底栖动物密度显著高于水库河段的结论一致。梯级水电站的运行改变了自然河段的占比，进一步影响底栖动物的物种多度。另外，中游的水电站数量明显多于下游，水电站的修建可能对部分底栖动物起到拦截作用，降低其纵向漂流的连续性[42]，部分类群可能重新建立栖息地，导致其多度增加。而由于下游起始点S09位于中游与雅砻江的交汇处，更多底栖动物类群经水流的运输作用在此处汇集，导致下游物种丰富度增加。
3.2 eDNA宏条形码技术在淡水底栖动物监测中的适用性
本研究证实了eDNA方法比传统调查法表现出明显优势。首先，eDNA检测到的物种丰富度明显高于传统方法，与大多研究结果一致[12，43]。其次，当前金沙江底栖动物的研究主要集中在可涉水支流[44]，干流底栖动物的研究较少，主要原因是干流河深水急，不仅采样难度大，而且安全性也低[45]。利用eDNA采集，不仅提高安全系数，同时具有非侵入性、高效灵敏性等特点。本次eDNA检测到了传统调查法未采集到的底栖动物种类，包括扁形动物门的单肠目和大口虫目，软体动物门的4个目以及节肢动物门的鞘翅目、襀翅目、毛翅目，这可能归功于eDNA方法可以通过卵、幼虫、肠道内容物或微量DNA即可监测到物种的存在[46]，也可能是由于应用传统调查法采样时受水深、流速、底质组成和交通工具等因素影响，采集时无法覆盖采样河段的所有生境。另外，这可能与本研究采集方式有关，如：平唇水龟甲科、长足虻科及水虻科栖息的生境比较特殊[47-48]，不适用于D型网采集，后续建议增加传统调查法的采集方式。最后，eDNA在每个样点均检测到底栖动物，而传统调查法有4个样点没有采集到样本，且只有少数样点采集到环节动物门及软体动物门（环节动物门在S02、S05、S14样点采集到；软体动物门在S05、S13~S16样点采集到），体现了eDNA方法在本次生物多样性研究中对传统调查法监测的补充作用，其中利用传统调查法在S07样点未采集到样本，反映了eDNA含量与物种生物量的正相关性[49]。
图5金沙江中下游样点底栖动物群落组成PCoA图（a: eDNA; b: 形态学）
Fig.5PCoA of macroinvertebrate community composition in the middle and lower reaches of Jinsha River (a: eDNA; b: morphology)
图6底栖动物群落组成与环境因素关系的CCA排序图 （a: eDNA; b: 形态学）（E: 样点上游电站年平均发电量）
Fig.6CCA of macroinvertebrate community composition and environmental variables (a: eDNA; b: morphology) (E: average annual power generation of power station in the upper reach of sampling sites)
传统方法监测到的端足目与等足目，eDNA方法并未监测到，这与Furlan的研究结果一致，当环境中生物个体数量较少时，物种的检测难度加大，这可能导致eDNA检测出现假阴性结果[50]。然而，eDNA检测到的帘蛤目物种多度占比最高，但传统方法个体数量远低于其他类群，表明eDNA在检测底栖动物数量方面仍存在局限性。研究表明，底栖动物物种条形码本地数据库不完整、通用引物的分辨率限制、目标物种eDNA浓度过低、样品本身的理化特性等因素均可能导致假阴性结果[51]。由于本研究使用的本地数据库中已包括端足目与等足目的目标片段，且形态学结果表明端足目与等足目均在S14中被检测。然而，eDNA并未在该样点采集到目标片段或高度聚类的片段，表明端足目与等足目类群并未被成功采集或扩增。因此，本研究猜测假阴性结果可能与通用引物的局限性或目标片段的eDNA浓度等有关。后续研究应逐一排除可能的影响因素，如通过多重PCR[52]以排除通用引物的局限性因素。另外，研究表明，死亡个体也能通过eDNA方法被检测[53]，但是形态结果并未将采集前已死亡的个体计入，导致两种方法检测到的帘蛤目出现多度上的偏差。因此，后续研究建议结合eRNA等方法以判断生物个体的存活状态。此外，不排除eDNA仅检测到目标对象的排泄物等胞外物质的可能。同时，在野外实验中，eDNA对生物量估算时效率较低[54]。因此，定量研究应成为eDNA后续工作重点之一。本研究中，eDNA与传统方法监测到的物种在反映群落结构方面有较高的一致性。如：eDNA技术检测到昆虫纲20个OTU（43.5%），传统调查法检测到昆虫纲17个分类单元（58.6%），两种方法均表明金沙江中下游干流的昆虫纲物种多样性最丰富。在目级水平的监测上也有较高的一致性（35%），包括双翅目、蜉蝣目、十足目、中腹足目、帘蛤目与贻贝目。
基于流体动力学建模的方法研究表明，eDNA在水体中随水流向下游移动的距离通常不超过2 km[55]。由于金沙江的水流速度较快，因此本研究设置的相邻样点之间的距离远超过2 km。除流速外，eDNA的生成、降解和稀释等因素均会影响其在流水系统中的检测距离和有效性[9]。Minamoto等[56]研究发现，水生动物释放的eDNA在水体中的存留时间一般为7~30天，而不同生物种类的生活史特征会影响eDNA的释放速率。因此，本研究检测多个采集与扩增的平行样品，并确保每个采集样品间隔超过5 m，以验证样品的重复性。尽管eDNA来源与激流系统的检测样点之间存在许多干扰因素，但多项研究表明，eDNA在揭示空间生物多样性方面具有重要的参考价值[9]。另外，由于栖息地的多样性，底栖动物eDNA多分布于沉积物及水体中，但是大量研究仍主要通过采集水体以获取淡水的底栖动物eDNA[57]，与沉积物中的eDNA相比，水体eDNA具有更短的环境驻留时间，其信号更可能反映近期的生物多样性。Deiner等[7]认为，从工作效率和降低工作强度角度考量，在区域或流域尺度开展底栖动物多样性评估时，建议优先选择eDNA方法。首先，相较于传统形态学方法，eDNA方法能显著减少采样工作量与人力成本。其次，eDNA在水体中的扩散特性使其在流域尺度上整合多河段生物信号，与单一河段的生物多样性相比，可更高效地表征大尺度生物分布模式。综上，基于eDNA方法在本次调查中表现出的优势以及成本因素等，本研究认为通过eDNA方法监测金沙江底栖动物多样性是可行的。
3.3 金沙江底栖动物空间分布差异的影响因素
根据多元方差分析检验结果，中下游的底栖动物群落结构差异具有显著性。结合eDNA与形态学的CCA分析结果，中下游底栖动物群落的变化和海拔有关。金沙江中游海拔（（1336.88±356.951）m）明显高于下游（（483.38±238.98）m）（附表Ⅲ），且中游底栖动物多样性及分布均匀度更低。这与Chinche[58]及Suren[59]的研究结果一致，生物多样性在海拔高的地方会出现下降趋势。
基于eDNA结果表明，中下游底栖动物群落的变化与高锰酸盐指数有关，高锰酸盐指数可反映水体中有机物及还原性无机物的污染程度，是水质监测的重要指标[60]。金沙江下游的攀枝花至屏山河段是泥沙主要产生区间[16]，水电站的拦沙作用会导致出库沙量大幅减少[61]。高锰酸盐指数在中游样点（S01~S08）及位于下游水电站后的样点（S10~S16）普遍偏低，位于泥沙产出区间的S09样点高锰酸盐指数高于其他样点约2~3倍。本研究结果与禹雪中等[62]的研究结果一致，含沙量显著影响高锰酸盐指数的浓度，因此本研究认为，在金沙江流域，高锰酸盐指数很大程度上反映了泥沙含量，故而对底栖动物群落产生了显著影响。
基于形态学结果进一步表明，样点上游电站年平均发电量是影响金沙江干流底栖动物群落空间分布格局的主要影响因素之一。金沙江中游样点上游电站年平均发电量明显大于下游，物种丰富度较下游低。研究表明，梯级水坝的运行会导致底栖动物群落结构产生变化[63]。电站发电量对群落结构的影响主要体现在水流量、水质的变化等方面，大坝发电排放的水流会扰乱物种正常的行为模式，包括产卵活动、迁徙动物的行进速度等[64]，导致物种丰富度下降。
4 结论
eDNA宏条形码技术与传统调查方法相比，在监测金沙江中、下游干流2月的底栖动物群落结构时有明显的优势。eDNA的检测效率与监测对象的生物量、条形码数据库的完整性等多个因素有关，未来应继续致力于本地数据库的完善以及eDNA技术的扩展研究。eDNA监测结果表明，金沙江下游的底栖动物多样性明显高于中游，底栖动物组成的空间差异主要与海拔、高锰酸盐指数及上游电站年平均发电量有关，说明底栖动物群落组成与水域环境变化及人为干扰程度密不可分。因此，未来应积极开展长期的水生生物监测和生态多样性调查工作，重点关注生物多样性衰退的流域，加强流域生境保护，因地制宜，合理开发水坝工程。
5 附录
附表Ⅰ~Ⅳ和附图Ⅰ~Ⅱ见电子版（DOI：10.18307/2025.0331）。
图1金沙江中下游采样点分布
Fig.1Sampling sites located at the middle and lower reaches of Jinsha River
图2底栖动物群落组成弦图（a: 形态学；b: eDNA）（外圈：中游、下游、目级分类单元； 中圈：采样点、序列丰度；内圈：采样点群落组成）
Fig.2Chord diagram of macroinvertebrate community composition (a: morphology; b: eDNA） （Outer circle: middle reach, lower reach, and order taxonomic category; Middle circle: sampling sites, sequence abundance; Inner circle: community composition of sampling sites)
图3底栖动物群落组成热图 （颜色梯度表示相对多度等级，eDNA数据范围为0~4，形态学数据范围为0~3）
Fig.3Heatmap of macroinvertebrate community composition (color gradients indicate relative abundance levels, with eDNA data ranging from 0 to 4 and morphological data ranging from 0 to 3)
图4底栖动物群落多样性比较（a: eDNA _ Shannon; b: eDNA _ Simpson; c: eDNA _ Pielou; d:形态学 _ Shannon; e: 形态学 _ Simpson; f: 形态学 _ Pielou）
Fig.4Comparisons of species diversity indices of macroinvertebrate (a: eDNA _ Shannon; b: eDNA _ Simpson; c: eDNA _ Pielou; d: morphology _ Shannon; e: morphology _ Simpson; f: morphology _ Pielou)
图5金沙江中下游样点底栖动物群落组成PCoA图（a: eDNA; b: 形态学）
Fig.5PCoA of macroinvertebrate community composition in the middle and lower reaches of Jinsha River (a: eDNA; b: morphology)
图6底栖动物群落组成与环境因素关系的CCA排序图 （a: eDNA; b: 形态学）（E: 样点上游电站年平均发电量）
Fig.6CCA of macroinvertebrate community composition and environmental variables (a: eDNA; b: morphology) (E: average annual power generation of power station in the upper reach of sampling sites)
表1金沙江中游与下游河段环境变量差异（均值±标准差）
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